牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法。首先通过分子克隆方法克隆获得包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子序列，亚克隆至pMD19-T-Promoter载体，再利用KpnI和XhoI限制性内切酶双酶切后，将其产物纯化回收，并连接在pGL3-Basic质粒上，转化大肠杆菌JM109，挑取鉴定后的阳性克隆子，进行大量制备和保藏。此法构建的包含牛FATP1基因第一外显子的5’侧翼启动子的荧光素酶质粒（pGL3-Basic-Promoter），可转染细胞，进行启动子功能活性分析，以筛选出高效的组织特异性启动子，克服目前动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目的不足及调控能力较弱的缺陷。
【专利说明】牛脂肪酸转运蛋白1基因启动子荧光素酶质粒的构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子遗传学领域，尤其是一种牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法。
【背景技术】
[0002]生物工程领域中，为了筛选活性较高的组织特异性启动子，常常需要进行启动子片段荧光素酶质粒构建。此法构建的质粒，灵敏度高，便于启动子活性检测，是目前研究启动子功能的必要手段。大量研究表明，FATPl参与了长链脂肪酸的跨膜转运及脂肪代谢过程，并促进长链和极长链脂肪酸进入细胞，根据代谢需要协调游离脂肪酸的摄取，从而影响脂肪的分布与沉积，是改善动物肉质的重要候选基因之一。
【发明内容】
[0003]技术要求
本发明所要解决的技术问题是提供一种牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，它能筛选出组织特异性启动子，为今后外源基因的高效表达奠定基础。
[0004]本发明是这样实现的:牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，包括以下步骤:
(1)利用生物信息学软件分析牛基因5’侧翼启动子序列，预测出核心启动子序列和转录因子结合位点；
(2)根据真核表达载体中多克隆位点区，结合已获得启动子片段以及限制性内切酶酶切反应效率，选取Kp`n和ZAo两种限制性内切酶酶切位点用于构建pGL3-Basic-Promoter真核表达载体；设计带有酶切位点的特异性引物，将酶切位点分别加在上下游引物的5’端，并在酶切位点的5’端添加2~3个保护性碱基；
(3)将包含牛基因第一外显子的5’侧翼启动子序列插入/7細载体，构建包含午FATPl基因第一外显子的5’侧翼启动子序列的载体；
(4)将牛/^7P7基因启动子片段插入载体的命/?与Xho位点间，构建牛FATPl基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic-Promoter。
[0005]步骤(2)中所述的带有酶切位点的特异性引物包括，上游引物5’ -GGGGTACCGCATCCCCACTCAACTAATAC-3’，以及下游引物 5’ -CCGCTCGAGCCACAG AGTCCTTTAITTGC-3’，带下划线的序列为引入的两个带保护碱基的酶切位点命和通ο位点。
[0006]有益效果
本发明选取牛FATPl基因启动子作为目的片段，构建其荧光素酶报告基因质粒，进而分离获得具有较高调控能力兼具组织表达特性的片段，以期找到高效的组织特异性启动子，克服目前动物基因工程中可利用的组织特异性启动子数目的不足及调控能力较弱的缺陷，为日后利用该启动子提供技术储备。【专利附图】
【附图说明】
[0007]图1为年FATPl基因5’侧翼序列TSS预测；
图1中阴影位置和带方框位置分别表示软件预测的转录起始位点和转录调控元件；
图2不同物种FATPl基因5’侧翼区的序列比对；
图3不同物种FATPl基因启动子区域系统进化树；
图4为目的基因的PCR扩增结果；
M:10kb maker ;1、2:2164bp PCR 产物；
图5为启动子-T载体双酶切电泳检测；
M:10kb maker ； 1-.Kpn 与 Xho 双酶切产物；
图6为启动子-T载体PCR检测；
M:10kb maker ;1、2:2164bp 质粒 PCR 产物；
图7为启动子克隆测序结果的BLAST比对；
图8为启动子片段的PCR扩增图；
M:DL15000 ；1:2164bp启动子片段的PCR产物；
图9为pGL3-启动子重组质粒PCR与双酶切检测图；` M:DL15000 ;1、2:重组质粒的PCR与双酶切产物；
图10为启动子NCBI序列比对图；
图11年FATPl基因启动子荧光素酶质粒构建流程图。
【具体实施方式】
[0008]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0009]本发明的实施例:牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，包括以下步骤:
(一)利用生物信息学软件分析预测牛基因5’侧翼启动子序列(I)根据GenBank中收录的牛基因的mRNA (ΝΜ_001033625.2)与已经公布的牛基因组Blast比对,下载获得相应的启动子序列。利用网站Web Promote Scan Service(Bioinformatics and Molecular Analysis Section, Dan Prestridge)和 NeuralNetwork Promoter Prediction (Berkeley Drosophila Genome Project, M.G.Reese)进行转录起始位点预测，分析结果如图1所示。
[0010](2)使用在线分析软件 TFSEARCH (Parallel Application TRC Laboratory,RffCP, Japan)和PROMO (Algorithms and Data Structures for Information, Retrival,Domenec Farre)进行转录因子结合位点预测,分析结果详见表1。
【权利要求】
1.一种牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)利用生物信息学软件分析牛基因5’侧翼启动子序列，预测出核心启动子序列和转录因子结合位点 ； (2)根据真核表达载体中多克隆位点区，结合已获得启动子片段以及限制性内切酶酶切反应效率，选取命/7和XAo 两种限制性内切酶酶切位点用于构建pGL3-Basic-Promoter真核表达载体；设计带有酶切位点的特异性引物，将酶切位点分别加在上下游引物的5’端，并在酶切位点的5’端添加2~3个保护性碱基； (3)将包含牛基因第一外显子的5’侧翼启动子序列插入/7細载体，构建包含午FATPl基因第一外显子的5’侧翼启动子序列的载体； (4)将牛基因启动子片段插入载体的命/?与Xho位点间，构建牛FATPl基因启动子荧光素酶报告基因质粒pGL3-BasiC-Promoter。
2.根据权利要求1所述的牛脂肪酸转运蛋白I基因启动子荧光素酶质粒的构建方法，其特征在于:步骤(2)中所述的带有酶切位点的特异性引物包括，上游引物5’ -GGGGTACCGCATCCCCACTCAACTAATAC-3’，以及下游引物 5’ -CCGCTCGAGCCACAG AGTCCTTTAITTGC-3’，带下划线的序列为引入的两个带保护碱基的酶切位点式? 和位点。
【文档编号】C12N15/53GK103509811SQ201310340744
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】许厚强, 龚婷, 陈伟, 陈祥, 赵佳福 申请人:贵州大学