药用阿魏内生菌的扩繁方法
【专利摘要】本发明公开了一种药用阿魏内生菌的扩繁方法，主要是通过外植体制作、真菌的分离及培养、细菌的分离及培养、放线菌的分离及培养实现。本发明对阿魏内生菌进行分离，特别是对菌体的培养和扩繁,为进一步开发利用阿魏的药用原植物提供足够数量和可持续利用的菌体,进而恢复药用阿魏原植物的生态资源,具有重要的意义。
【专利说明】药用阿魏内生菌的扩繁方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种药用阿魏内生菌的扩繁方法。
【背景技术】
[0002]植物体内普遍存在着内生菌，由于其生活在没有外在感染症状的健康植物组织内部，因此植物内生菌的存在和作用长期以来未被发现。
[0003]直到20世纪30年代，由于牲畜食了感染内生真菌的牧草，给畜牧业造成重大损失，才开始对植物内生菌有了初步认识。
[0004]植物内生菌作为植物微生态系统的重要组成部分，在长期的协同进化过程中，与植物形成了互惠互利或者危害植物生长等关系。大部分内生菌具有增强宿主对外界环境的应激耐受性、促进宿主植物的生长及宿主中一些有效活性成分的合成(或自身具有合成某化合物能力)等方面的作用，深入研究可能对药用植物的人工种植及提高药用植物产量等具有重要作用。
[0005]阿魏味苦、辛，性温，归脾、胃经，有消积、散痞、杀虫的功效，是我国的传统中药，也是新疆特有的珍稀药材，被收入历版《中华人民共和国药典》一部，是基源为新疆阿魏(Ferula sinkiangensis K.M.Shen)或阜康阿魏(Ferufukanensis K.M.Shen)的树脂。
[0006]因药用阿魏植物自身生理生殖等方面的限制和长期以来的乱采滥挖，目前其资源遭到巨大破坏，已濒临灭绝，并被三级重点保护濒危植物。
[0007]药用阿魏内生菌主要有真菌、细菌和和放线菌，这些微生物的次级代谢产物及其与阿魏属植物生长的相 关性等进行研究，对恢复药用阿魏的生态资源具有重要的意义。
[0008]而在实际应用研究中，需要大量地用到内生菌菌体，而且菌体的培育又需要一个较长的过程，阿魏的药用原植物是多年生一次开花的早春类短命植物，含有丰富的树胶，但随着株龄逐年累积，这些树胶对内生菌的获得造成一定的困难，造成研究中菌体的严重缺乏，因此一定数量的菌体储备关系到研究的正常进行。
[0009]因此，对阿魏内生菌进行分离，特别是对菌体的培养和扩繁，为进一步开发利用阿魏的药用原植物提供足够数量的菌体，进而恢复药用阿魏原植物的生态资源，具有重要的意义。
【发明内容】
[0010]本发明的目的是提供一种药用阿魏内生菌的扩繁方法。
[0011]本发明的目的主要是通过以下过程实现的:
外植体制作:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成0.5?2cm的小段，经浓度65?85%的酒精消毒0.5?1.5分钟，再经浓度2?4%的次氯酸钠消毒5?8分钟，之后无菌水洗涤3?5次，浙干水置于2?5°C环境中保存备用。
[0012]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.3?0.6cm小块接种到培养基中，每个培养皿最好接种3?7块。[0013]所用的真菌培养基为麦麸培养基、孟加拉红培养基中的一种。
[0014]在温度23?27°C下，暗培养4?8天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。
[0015]所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0016]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为36?39°C下暗培养24?48小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。
[0017]所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0018]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养14?21天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。
[0019]所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0020]上述的细菌和放线菌的稀释液最好按以下步骤进行配制:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到所需的稀释液。
[0021]如果在已经拥有内生菌菌种的情况下，可直接进入培养扩繁。
.[0022]本发明对阿魏内生菌进行分离，特别是对菌体的培养和扩繁，为进一步开发利用阿魏的药用原植物提供足够数量和可持续利用的菌体，进而恢复药用阿魏原植物的生态资源，具有重要的意义。
【具体实施方式】
[0023]培养基的配制如下。
[0024]麦麸培养基:将麦麸250?350g加入IL水中煮30min以上，取汁，按汁再加入葡萄糖150?250 g/L，磷酸二氢钾25?35 g/L，硫酸镁10?20 g/L，琼脂100?150 g/L。
[0025]孟加拉红培养基:蛋白胨4?6g,葡萄糖8?12g,磷酸二氢钾0.5?1.5g,硫酸镁(MgS04.7H20)0.3?0.6g，琼脂15?25g，1/3000孟加拉红溶液IOOmL,蒸馏水IOOOmL,氣霉素 0.05 ?0.15g。
[0026]PDA培养基:100?300g 土豆洗净，切成I?2 cm大小的块状，加入IL水中煮沸15?20min，纱布过滤取汁，加入15?25g葡萄糖，15?25g琼脂后定容至IOOOmL,待冷却至60度以内时加入0.5?1.5g的链霉素，以抑制细菌和放线菌的生长；纯化待保藏时，不
加链霉素。
[0027]牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏2?4g，蛋白胨8?12g，Nacl5g，琼脂15?20g，水IOOOmL,调 pH 值至 PH7.4 ?7.6。
[0028]高氏一号培养基:将可溶性淀粉15?25g、硝酸钾0.5?1.5g、K2HPO4 0.4?
0.6g、MgS04.7Η20 0.4 ?0.6g、氯化钠 0.4 ?0.6g、硫酸亚铁 0.01 ?0.02g、琼脂 15 ?30g，溶入蒸馏水1000 mL中，再加入2?4%的重铬酸钾溶液2?6ml，调pH值至7.2?7.4。
[0029]实施例1:取新鲜的新疆阿魏的根作为外植体，切成Icm的小段，经浓度70%的酒精消毒1.5分钟，再经浓度3%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤3次，浙干水置于4°C环境中保存备用。
[0030]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.3cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿中接种5块；在温度25°C下，暗培养5天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0031]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为38°C下暗培养24小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0032]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养15天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0033]实施例2:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成1.5cm的小段，经浓度75%的酒精消毒1.5分钟，再经浓度2%的次氯酸钠消毒8分钟，之后无菌水洗涤5次，浙干水置于5°C环境中保存备用。
[0034]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.5cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿接种7块；在温 度23°C下，暗培养8天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0035]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为39°C下暗培养2小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0036]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养15天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0037]实施例3:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成2cm的小段，经浓度80%的酒精消毒I分钟，再经浓度4%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤3次，浙干水置于3°C环境中保存备用。
[0038]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体,切成0.5cm小块接种到孟加拉红培养基中，每个培养皿接种4块；在温度26°C下，暗培养6天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0039]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为37°C下暗培养36小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0040]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_4?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养20天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0041]实施例4:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成0.5cm的小段，经浓度65%的酒精消毒I分钟，再经浓度4%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤3次，浙干至无滴水现象后置于2°C环境中保存备用。
[0042]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.5cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿接种6块；在温度26°C下，暗培养5天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0043]细菌的分离 及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为37°C下暗培养24小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0044]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_4的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养18天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0045]实施例5:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成0.5cm的小段，经浓度70%的酒精消毒0.5分钟，再经浓度3%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤5次，浙干至无沆水后置于4°C环境中保存备用。
[0046]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体,切成0.5cm小块接种到孟加拉红培养基中，每个培养皿接种7块；在温度25°C下，暗培养5天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0047]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为39°C下暗培养24小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0048]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_3?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养15天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0049]实施例6:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成2cm的小段，经浓度70%的酒精消毒I分钟，再经浓度3%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤4次，浙干水置于3°C环境中保存备用。
[0050]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.3cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿接种5块；在温度26°C下，暗培养6天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0051]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为36?39°C下暗培养24?48小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌.落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0052]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_2?10_3的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养14?21天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0053]实施例7:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成1.5cm的小段，经浓度85%的酒精消毒1.5分钟，再经浓度4%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤5次，浙干至无滴水后置于4°C环境中保存备用。
[0054]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.5cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿接种5块；在温度24°C下，暗培养6天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0055]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为37°C下暗培养24小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0056]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_4?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养20天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0057]实施例8:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成Icm的小段，经浓度70%的酒精消毒I分钟，再经浓度3%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤4次，浙干水置于4°C环境中保存备用。
[0058]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体,切成0.5cm小块接种到孟加拉红培养基中，每个培养皿接种5块；在温度25°C下，暗培养5天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0059]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为37°C下暗培养48小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0060]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_2?10_3的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养18天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
.[0061]实施例9:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成1.2cm的小段，经浓度70%的酒精消毒I钟，再经浓度2%的次氯酸钠消毒6分钟，之后无菌水洗涤3次，浙干水置于3°C环境中保存备用。
[0062]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.3?0.6cm小块接种到孟加拉红培养基中，每个培养皿接种6块；在温度27°C下，暗培养4天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0063]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为36°C下暗培养48小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0064]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养20天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0065]实施例10:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成0.8cm的小段，经浓度75%的酒精消毒1.5分钟，再经浓度3%的次氯酸钠消毒5分钟，之后无菌水洗涤3次，浙干水置于3°C环境中保存备用。
[0066]真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.4cm小块接种到麦麸培养基中，每个培养皿接种7块；在温度25°C下，暗培养5天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
[0067]细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为38°C下暗培养24小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落。所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
[0068]放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养16天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落 ，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
【权利要求】
1.一种药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于主要包含以下过程: 外植体制作:取新鲜的新疆阿魏、阜康阿魏、羊食阿魏的根作为外植体，切成0.5?2cm的小段，经浓度65?85%的酒精消毒0.5?1.5分钟，再经浓度2?4%的次氯酸钠消毒5?8分钟，之后无菌水洗涤3?5次，浙干水置于2?5°C环境中保存备用； 真菌的分离及培养:将上述消毒的外植体，切成0.3?0.6cm小块接种到麦麸培养基或孟加拉红培养基培养基中，每个培养皿接种3?7块； 在温度23?27°C下，暗培养4?8天，待菌丝长出后，挑取菌丝尖端，置于PDA培养基中逐级纯化，直至形成单个菌落； 细菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_3?10_6的稀释液，置入牛肉膏蛋白胨培养基中，在温度为36?39°C下暗培养24?48小时后，挑取单个菌落逐级划线培养，直至形成单个菌落； 放线菌的分离及培养:取消毒后的阿魏外植体，匀浆，然后按重量用无菌水稀释成含量为10_2?10_5的稀释液，置入高氏一号培养基中暗培养14?21天后，挑取边缘少量菌丝逐级纯化培养，直至形成单个菌落。
2.根据权利要求1所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑 取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
3.根据权利要求1或2所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的逐级划线培养:将不纯的菌落挑单菌落划线培养至单菌落，对于未纯化菌落，继续挑菌划线培养，直至变为单菌落。
4.根据权利要求1或2所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
5.根据权利要求3所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的逐级纯化为:将不纯的菌落挑取边缘菌丝置于培养皿中纯化培养至单菌落，对于未纯化的菌落，继续挑取边缘纯化直至变为单菌落。
6.根据权利要求1或2所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的细菌或放线菌的稀释液按以下步骤进行配制:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到所需的稀释液。
7.根据权利要求3所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的细菌或放线菌的稀释液按以下步骤进行配制:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到所需的稀释液。
8.根据权利要求4所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的细菌或放线菌的稀释液按以下步骤进行配制:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到所需的稀释液。
9.根据权利要求5所述的药用阿魏内生菌的扩繁方法，其特征在于:所述的细菌或放线菌的稀释液按以下步骤进行配制:取消毒后的阿魏外植体，放入已消毒的研钵中研碎呈浆状，按每I克浆状体，加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，然后从中吸取上清液体，再按I毫升加入8?12毫升无菌水，混匀后静置20分钟以上，依次继续稀释，得到所需的稀释液。.
【文档编号】C12N1/20GK103436469SQ201310353245
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年8月14日 优先权日:2013年8月14日
【发明者】李晓瑾, 朱军, 孙丽, 樊丛照, 阿伊别克·热合木都拉 申请人:新疆维吾尔自治区中药民族药研究所