一种同时检测五种呼吸道病毒的引物、探针及其用途
【专利摘要】本发明涉及一种同时检测五种呼吸道病毒的引物、探针及其用途，具体地，提供一种同时检测呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5'utr、RSVA-f、FluA-m1、RSVB-f的引物探针组合、包含上述引物探针组合的试剂盒以及它们的用途。本发明采用特异性引物和带有荧光标记探针的混合溶液，对批量样本进行PCR扩增，再进行微卫星分析，一次性可分析大量样本，可同时对临床常见的五种呼吸道病毒进行检测，显著提高效率，且灵敏度高，所述的试剂盒可在临床推广使用，具有广阔的应用前景。
【专利说明】—种同时检测五种呼吸道病毒的引物、探针及其用途
[0001]本申请是针对申请号:201110419283.X，申请日:2011年12月15日，发明创造名称为:一种检测多种呼吸道病毒的引物、探针及方法，的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及病毒诊断【技术领域】，具体地说，是一种同时检测五种呼吸道病毒的引物、探针及其用途。
【背景技术】
[0003]呼吸道病毒是一类能侵犯呼吸道引起呼吸道局部病变或仅以呼吸道为侵入门户，主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起，且其传染性和致病性很强，一般经过唾液飞沫即可在人与人之间直接传播。因此，必须加强对呼吸道病毒的诊断，以积极治疗、防止传播。
[0004]呼吸道病毒包括正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的流感病毒；副粘病毒科(Paramyxoviridae)中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疫病毒、腿腺炎病毒以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、风疹病毒、鼻病毒、冠状病毒和呼肠病毒等。临床上常见的呼吸道病毒包括呼吸道合胞病毒A (RSVA)和呼吸道合孢病毒B (RSVB)、流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型(FluA和FluB)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒1_4型(PIV1-PIV4)、肠道病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、冠状病毒(0C43、229E/NL63)、人偏肺病毒(MPV)和人博卡病毒(HBoV)这15种。其检测方法常用的有病毒分析法、血清学诊断、免疫荧光法和核酸杂交、PCR或序列分析检测病毒核酸的方法。而这些方法当中，核酸检测方法因其灵敏度高、特异性强、检测速度快而优于其他方法。但是当临床需检测样本较多时，对于核酸检测方法，如采用仅针对单一病毒的单一反应体系，则工作量极大，费时费力且浪费资源。
[0005]中国专利文献CN 201010542857.8，申请日2010年11月12日，公开了一种检测多种呼吸道病毒的方法及其引物与探针，该发明对腺病毒、人偏肺病毒、流感病毒A型、流感病毒B型、呼吸道合胞病毒、博卡病毒、鼻病毒、冠状病毒(HKUl、NL63和SARS )、副流感病毒(I型、II型、III型和IV型)共14中呼吸道病毒核酸序列进行分析，设计相应的反转录引物、PCR引物和特异性探针，以反转录和多重不对称PCR的方法扩增特定基因偏度，采用液相芯片技术将偶联偶病毒特异性探针的荧光编码微球组与PCR扩增产物温育杂交，然后用Bio-PleXTM200进行检测。该发明虽然通量较大，在一定程度上加快了检测速度，但是该方法首先需要将核酸探针和微球偶联，最后还需要将样本的PCR扩增产物与核酸探针微球组进行杂交、标记，程序较为繁琐，另外，该方法并不能诊断冠状病毒0C43、229E/NL63等病毒，因此，亟需一种可同时检测多种呼吸道病毒、更为快速、经济、有效的检测方法。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种检测多种呼吸道病毒的引物组口 。[0007]本发明的再一的目的是，提供一种检测多种呼吸道病毒的探针组合。
[0008]本发明的另一的目的是，提供一种检测多种呼吸道病毒的方法。
[0009]本发明的第四个目的是，提供一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒。
[0010]本发明的第五个目的是，提供一种上述引物和探针的用途。
[0011]为实现上述目的，本发明采取的技术方案是:
一种检测多种呼吸道病毒的引物组合，所述的引物组合是由下列引物对中的一对或几对组成:SEQ ID N0.1-2、SEQ ID N0.3-4、SEQ ID N0.5-6、SEQ ID N0.7-8、SEQ IDN0.9-10、SEQ ID N0.11-12、SEQ ID N0.13-14、SEQ ID N0.15-16、SEQ ID N0.17-18、SEQID N0.19-20、SEQ ID N0.21-22、SEQ ID N0.23-24、SEQ ID N0.25-26、SEQ ID N0.27-28、SEQ ID N0.29-30。
[0012]所述的引物组合是:
(a)引物组合 I:SEQ ID N0.1-2、SEQ ID N0.3-4、SEQ ID N0.5-6、SEQ ID N0.7-8 和SEQ ID N0.9-10 ;或
(b)引物组合II:SEQ ID N0.11-12、SEQ ID N0.13-14、SEQ ID N0.15-16、SEQ IDN0.17-18 和 SEQ ID N0.19-20 ;或
(c)引物组合III:SEQ ID N0.21-22、SEQ ID N0.23-24、SEQ ID N0.25-26、SEQ IDN0.27-28 和 SEQ ID N0.29-30。
[0013]为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是:
一种检测多种呼吸道病毒的探针组合，所述的探针组合是由核苷酸序列如SEQ IDN0.31-45所示的探针中的一种或几种组成。
[0014]所述的探针组合是:
(a)探针组合I:SEQ ID N0.31~35 ;或
(b)探针组合I1:SEQ ID N0.36~40 ;或
(c)探针组合III:SEQ ID N0.41 ~45。
[0015]所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.31~35所示的探针的5’端被6_羧基荧光素所修饰；所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.36~40所示的探针的5’端被六氯荧光素氨基磷酸酯所修饰；所述的核苷酸序列如SEQ ID N0.41-45所示的5’端被羧基-X-罗丹明琥珀酰亚胺酯所修饰。
[0016]为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是:
一种检测多种呼吸道病毒的方法，它是以呼吸道粘液样本的反转录产物为模板，使用特异性扩增两种或两种以上的呼吸道病毒的引物组合，以及对应的特异性探针组合进行PCR反应，再以反应产物为样品进行微卫星检测。
[0017]所述的方法是以呼吸道粘液样本的反转录产物为模板，使用 Ca)如上所述的引物组合I，和如上所述的探针组合I ;或
(b)如上所述的引物组合II，和如上所述的探针组合II;或
(c)如上所述的引物组合III，和如上所述的探针组合III进行PCR反应，再以反应产物为样品进行微卫星检测。
[0018]为实现上述第四个目的，本发明采取的技术方案是:
一种检测多种呼吸道病毒的试剂盒，它包括以下试剂:(a)引物:如上所述的引物组合I和/或引物组合II和/或引物组合III；
(b)探针:如上所述的探针组合I和/或探针组合II和/或探针组合III。
[0019]所述试剂盒还包括dNTPs、PCR反应液和DNA聚合酶。
[0020]为实现上述第五个目的，本发明采取的技术方案是:
SEQ ID N0.1-45所示的核苷酸序列在检测呼吸道病毒中的应用。
[0021]本发明优点在于: 1、本发明的引物和探针的特异性强，灵敏度高，可准确检测多种呼吸道病毒；
2、本发明采用特异性引物和带有荧光标记探针的混合溶液，对批量样本进行PCR扩增，再进行微卫星(STR)分析，一次性可分析大量样本，同时对多种呼吸道病毒进行检测，减少操作步骤，节省资源，提高效率；
3、本发明的试剂盒可广泛应用于临床呼吸道病毒的检测，具有广阔的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]附图1是样本一的荧光标记为6 FAM的图谱。
[0023]附图2是样本一的荧光标记为HEX的图谱。
[0024]附图3是样本二的荧光标记为6 FAM的图谱。
[0025]附图4是样本二荧光标记为ROX的图谱。
[0026]附图5是样本三的荧光标记为HEX的图谱。
[0027]附图6是样本四的荧光标记为6 FAM的图谱。
[0028]附图7是样本五的荧光标记为HEX的图谱。
[0029]附图8是样本六的荧光标记为HEX的图谱。
[0030]附图9是样本七的荧光标记为ROX的图谱。
[0031]附图10是样本八的荧光标记为ROX的图谱。
[0032]附图11是样本九的荧光标记为ROX的图谱。
【具体实施方式】
[0033]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0034]实施例1
使用本发明的引物和探针检测多种呼吸道病毒 I材料与方法
1.1样本来源
通过合作关系收集2009年6月7日到2010年6月5日上海交通大学医学院附属新华医院发热门诊就诊的有发热、咳嗽、流涕和咽痛等散发上呼吸道感染症状的0-1岁患儿62例，进行检测，抽取9例，分别记为样本一-样本九。
[0035]1.2标本采集和病毒核酸的提取与反转录 使用咽拭子，采集患儿上呼吸道黏液。咽拭子置4ml转运液(内含Hanks液与10%甘油)，4°C运送至实验室，_70°C保存备用。用病毒RNA/DNA提取试剂盒(购于Promega公司)提取样本中的病毒总RNA/DNA，针对RNA病毒先反转录成cDNA，_20°C保存备用。
[0036]1.3合成PCR扩增引物和探针利用生物信息学知识和DNAstar等相关生物信息学软件，对Genbank数据库中所能检索到的呼吸道合胞病毒A (RSVA)和呼吸道合孢病毒B (RSVB)、流行性感冒病毒A型和流行性感冒病毒B型(FluA和FluB)、鼻病毒(HRV)、副流感病毒1-4型(PIV1-PIV4)、肠道病毒(HEV)、腺病毒(ADV)、冠状病毒(0C43、229E/NL63)、人偏肺病毒(MPV)和人博卡病毒(HBoV)的核酸序列进行病毒基因序列比对分析，选定各种病毒的特异性序列，设计出针对各种病毒的相应特异性基因片段的简并PCR引物(见表I)和特异性核酸探针(见表2)。所有简并引物和探针由TaKaRa公司合成。
[0037]表I引物序列及扩增的目的片段长度
【权利要求】
1.一种同时检测呼吸道病毒 0C43-pol、hRV-5’ utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的引物探针组合，其特征在于，所述的引物探针组合选自下列中的一种或几种: a)引物对SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12 和探针 SEQ ID N0.36 ； b)引物对SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14 和探针 SEQ ID N0.37 ； c)引物对SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16 和探针 SEQ ID N0.38 ； d)引物对SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 和探针 SEQ ID N0.39 ； e)引物对SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20 和探针 SEQ ID N0.40。
2.根据权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述的核苷酸序列如SEQIDN0.36-40所示的探针的5’端被6-羧基荧光素所修饰。
3.权利要求1或2所述的引物探针组合在制备检测呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5’utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的试剂中的应用。
4.一种同时检测呼吸道病毒 OC43-pol、hRV-5’ utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的试剂盒，其特征在于，它包括以下试剂中的一种或几种: a)引物对SEQ ID N0.1USEQ ID N0.12 和探针 SEQ ID N0.36 ； b)引物对SEQ ID N0.13、SEQ ID N0.14 和探针 SEQ ID N0.37 ； c)引物对SEQ ID N0.15、SEQ ID N0.16 和探针 SEQ ID N0.38 ； d)引物对SEQ ID N0.17、SEQ ID N0.18 和探针 SEQ ID N0.39 ； e)引物对SEQ ID N0.19、SEQ ID N0.20 和探针 SEQ ID N0.40。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，它还包括dNTPs、PCR反应液和DNA聚合酶。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在制备检测呼吸道病毒OC43-pol、hRV-5’utr、RSVA-f、FluA-ml、RSVB-f 的试剂中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103451317SQ201310353132
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2011年12月15日 优先权日:2011年12月15日
【发明者】周晓明, 胡芸文, 张璐, 王宏萍, 张国翠 申请人:上海市公共卫生临床中心