一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF、β-巯基乙醇和非必需氨基酸组成。本发明的培养基适用于人羊膜上皮细胞的培养，尤其适用于原代人羊膜上皮细胞的分离和纯化过程中的培养，同时可以降低移植人体过程中引发免疫反应的几率。
【专利说明】一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，具体的说涉及一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基。
【背景技术】
[0002]人羊膜上皮细胞(amn1tic epithelial cells, AECs)在受精后第8天由外胚层细胞发育而来，使其可能维持原肠胚形成胚胎干细胞的可塑性。人羊膜上皮细胞不表达HLA-A，B，C或DR抗原，移植后不易引起免疫排斥反应。在一定条件下，人羊膜上皮细胞可分化为成熟的神经元细胞，毛囊和皮肤上皮细胞，人羊膜上皮细胞理论上可以分化成为各种组织细胞。因此，对人羊膜上皮细胞培养方法的探索及对人羊膜上皮细胞的生长特性的研究具有重要意义，可为将来的组织工程应用奠定基础。
[0003]人羊膜上皮细胞是从人胎盘羊膜上分离得到，而人羊膜组织由来源于外胚层的羊膜上皮细胞和中胚层的羊膜间质细胞组成。传统的方法很难从羊膜中分离得到高纯度的羊膜上皮细胞。
[0004]目前人羊膜上皮细胞的体外大多采用小鼠3T3细胞作为滋养细胞，滋养细胞对羊膜上皮细胞的生长、增殖有促进作用。但3T3细胞是异种细胞，所含蛋白移植到人体内会引起免疫反应。
【发明内容】
[0005]本发明提供一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF (表皮生长因子)、巯基乙醇、非必需氨基酸成分组成；
[0006]其中DMEM(Deulbecco’s Modified Eagle Medium,改良 Eagle 培养基)，可以为低糖的，也可以为高糖，优选为低糖DMEM ；DMEM的含量为10g/1000ml ；
[0007]其中胎牛血清的体积含量为5?15%，优选含量为10% ；
[0008]其中丙酮酸钠的含量为0.0550?0.2200g/1000ml ;优选的为0.1100g/1000ml ；
[0009]其中L-谷氨酰胺的含量为0.0731?0.2193g/1000ml ;优选的为0.1461g/1000ml ；
[0010]其中β -巯基乙醇的含量为1.9287?5.7861g/1000ml ;优选的为3.8574g/1000ml ；
[0011]其中EGF的含量为5?15ng/ml ;优选的为10ng/ml ；
[0012]其中非必需氨基酸的含量为0.5mM?2mM，优选含量为ImM，其中10mM非必需氨基酸的组成为:L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸 1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-丝氨酸 1050mg/L ；
[0013]本发明的用于培养人羊膜上皮细胞的培养基的PH值保持在7.0?7.4，优选PH值为 7.2。
[0014]将以上组分混合，即可得到培养人羊膜上皮细胞的培养基。
[0015]本发明的培养基适用于人羊膜上皮细胞的培养，尤其适用于原代人羊膜上皮细胞的分离和纯化过程中的培养。本发明培养基能使在无3T3细胞的情况下成功得使人羊膜上皮细胞生长、扩增。相对于传统的培养人羊膜上皮细胞的培养基，本发明培养基能优先促进人羊膜上皮细胞的生长，同时抑制其他杂细胞的生长。由于不含3T3细胞，使得羊膜上皮细胞的培养变得简单、高效，同时降低了移植人体过程中引发免疫反应的几率。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为实施例2获得的原代羊膜上皮细胞培养三天后的AECs的细胞动态图；
[0017]图2为实施例2获得的原代羊膜上皮细胞培养五天后的AECs的细胞动态图；
[0018]图3为实施例2获得的AECs传代培养三天后的细胞动态图；
[0019]图4为实施例2获得的AECs传代培养后的SSEA-4的流式细胞术检测结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合实施例，对如何应用本发明的培养人羊膜上皮细胞的培养基从羊膜组织中分离得到高纯度的羊膜上皮细胞，做进一步详细说明。
[0021]实施例1:1000ml人羊膜上皮细胞的培养基的制备
[0022]890ml DMEM (gbico)培养基中加入胎牛血清(Hyclone) 10ml、丙酮酸钠(sigma)0.llOOg、L-谷氨酰胺(sigma) 0.1461g、β _ 巯基乙醇(sigma) 3.8574g、l μ g/ml 的 EGF(PEPROTECH) 100 μ 1、10mM非必需氨基酸10ml、所述的10mM非必需氨基酸配方为L-丙氨酸(sigma) 1500mg/L> L-天门冬酰胺(sigma) 890mg/L、L-天冬氨酸(sigma) 1330mg/L>L-谷氨酸(sigma)1470mg/L、甘氨酸(sigma)750mg/L、L-脯氨酸(sigma)1150mg/L 和 L-丝氨酸(sigma) 1050mg/L,充分混匀后，调节PH值至7.2，0.22 μ m滤膜过滤除菌，4°C保存。
[0023]实施例2:人羊膜上皮细胞的分离及培养
[0024]首先取经家属同意的且HIV、甲肝、乙肝以及梅毒等血清学反应显示为阴性的剖宫产分娩产妇的新鲜胎盘一个，由0.4g的KC1、0.06g的ΚΗ2Ρ04、0.132g的Na2HPO4.12H20、8g的NaCl,0.35g的NaHCO3U.0g的D-葡萄糖、0.20g的链霉素、0.12g的青霉素用水定容为IL的方法制作而成基础平衡盐反复冲洗干净，去除胎盘表面残留的血液；从胎盘上分离羊膜，并将其放入基础平衡盐溶液中反复漂洗，并重复两次；将干净的羊膜组织剪碎，获得直径为Imm的羊膜组织块；在剪碎的组织块中加入30ml0.2%IV胶原酶(gibco，批号:1177238),并置于37°C下孵育2小时；接着将混合了胶原酶的组织块在200g下离心5分钟，吸出胶原酶消化液；再加入15ml0.25%胰蛋白酶(sigma，批号:110M7362V)/0.0296EDTA消化液，在37°C振荡消化20分钟后，用30ml实施例1所制备的培养基终止消化；将消化后的组织块经200目滤网过滤；将滤液在200g下离心5分钟，弃上清，使用3ml实施例1所制备的培养基终重新悬浮细胞并细胞计数。按16?107cell/ml的细胞密度进行接种，并置于5%C02、37°C培养箱内培养；48小时后换液，然后在5%C02、37°C培养箱内继续培养，等到细胞增生到90%融合后收集细胞并鉴定。
[0025]实施例3:
[0026]细胞形态学观察:实施例2分离的原代羊膜上皮细胞培养24小时后大部分细胞贴壁，刚贴壁的细胞呈椭圆形，遮光性强，随后细胞胞质逐渐展开，折光性减弱。细胞贴壁3天后生长迅速，增殖明显，细胞数量明显增多，细胞进入指数生长期，如图1。5天左右形成单层，细胞融合成片，呈膜状生长。细胞呈扁平不规程多角形，轮廓清晰，胞浆丰富，细胞呈圆形卵圆形，如图2。传代培养8小时左右细胞贴壁，3天即可形成良好的单层，如图3。
[0027]实施例4:
[0028]用0.25%胰蛋白酶(sigma，批号:110M7362V) /0.02%EDTA消化液消化贴壁的AECs，用无钙镁PBS洗2两次后，取I X 16个/ml，加入FCM管中。加入待检测的单克隆抗体SSSEA-4 (BD，批号:23713)5 μ 1，4°C避光孵育30分钟，每隔10分钟摇晃一次，使细胞与抗体充分接触。用PBS洗2次，并重悬在400 μ I的PBS中，上流式细胞仪检测。图4为流式结果图。从图中可以看出本次实验得到SSSEA-4阳性细胞达到了 84.42%，最终证实本发明的方法可以得到高纯度的羊膜上皮细胞。
[0029]说明利用本发明的培养基培养原代人羊膜上皮细胞，通过多次传代后，成功抑制了羊膜间质细胞，获得高纯度的人羊膜上皮细胞。
[0030]在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述，但是，很显然仍可以做出修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明的说明书和附图被认为是说明性的而非限制性的。
【权利要求】
1.一种用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于该培养基由DMEM、胎牛血清、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、EGF、β -巯基乙醇和非必需氨基酸组成； 其中DMEM的含量为10g/1000ml ； 其中胎牛血清的体积含量为5?15% ； 其中丙酮酸钠的含量为0.0550?0.2200g/1000ml ； 其中L-谷氨酰胺的含量为0.0731?0.2193g/1000ml ； 其中β -巯基乙醇的含量为1.9287?5.7861g/1000ml ； 其中EGF的含量为5?15ng/ml ； 其中非必需氨基酸为L-丙氨酸、L-天门冬酰胺、L-天冬氨酸L、L-谷氨酸、甘氨酸L、L-脯氨酸和L-丝氨酸中组成；非必需氨基酸的含量为0.5?2mM。
2.根据权利要求1所述的用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于该培养基的PH值为7.0?7.4。
3.根据权利要求1所述的用于培养人羊膜上皮细胞的培养基，其特征在于其中非必需氨基酸的组成为=L-丙氨酸1500mg/L、L-天门冬酰胺890mg/L、L-天冬氨酸1330mg/L、L-谷氨酸 1470mg/L、甘氨酸 750mg/L、L-脯氨酸 1150mg/L 和 L-丝氨酸 1050mg/L。
【文档编号】C12N5/073GK104371970SQ201310355824
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2013年8月15日 优先权日:2013年8月15日
【发明者】刘洋, 吴明远, 胡少青, 赵静, 王翔, 叶萌, 张丽丽, 范星洲, 施洁琦 申请人:协和华东干细胞基因工程有限公司