一种高耐盐鲁氏接合酵母的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高耐盐鲁氏接合酵母A（ZygosaccharomycesrouxiiA）菌株，其保藏编号为CCTCC?NO：M2013310。该菌株具有高耐盐特性、较好的生长稳定性、能产生较浓郁的醇厚与酯香风味的特征，可用于高盐稀态酱油酿造，缩短发酵周期，提高酱油风味与品质。
【专利说明】一种高耐盐鲁氏接合酵母
【技术领域】
[0001 ] 本发明属于微生物【技术领域】,涉及一种高耐盐鲁氏接合酵母iZygosaccharomycesrouxi1、。该菌株可以在酱油酿造高盐环境下生长繁殖，能产生醇厚、酯香的酱油风味，提高醫油品质。
【背景技术】 [0002]酱油是我国一种传统的发酵调味品，深受我国及世界人民的喜爱。酱油是曲霉、酵母菌及细菌等微生物综合作用的产品，发酵时这些微生物产生的酶和代谢产物形成酱油的色香味成分，其中最重要的是酵母菌和乳酸菌，它们的主要作用是发酵糖类产生小分子醇、醛、酸、酯、酚类等风味物质，这是酱油风味产生的主要途径。
[0003]酱醅中分离出的酵母菌有7个属，32个种，其中与酱油质量关系最密切的是鲁氏接合酵母rouxii)、易变球拟酵母Fersa蒙奇球拟酵母ffiogii)、多变假丝酵母等。鲁氏酵母是最常见的耐高渗透压酵母，其特点是能生长在含糖量极高的物料中，也能在含18%食盐的培养基质中快速繁殖，主要作用是进行酒精发酵，与此同时进行各种香气成分如酯类的合成、甘油及多元醇的合成等。
[0004]高盐稀态发酵工艺是在我国传统发酵工艺上改进的，同时又吸收消化了日本的许多先进技术，发酵周期为3-6个月，酱油产品氨基酸态氮生成率高，约为全氮的60%左右，酱油风味好。在高盐稀态酱醪发酵过程中，为了提高酱油的风味，一般都要添加耐盐产香酵母，从而改善酱油酿造用米曲霉发酵风味的单一及不饱和性，全面提高酱油的风味及档次。鲁氏酵母的添加技术已经成熟，应用比较广泛，呈味效果已得到公认。
[0005]然而，人工添加的酵母可能不适应酱油酿造过程中的高盐环境，并不能很好地发挥作用。因此筛选耐高盐的酱油酵母菌株是改善酱油风味、提高酱油质量的重要手段之一。
【发明内容】
[0006]鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一株耐高盐的应用于酱油酿造的产醇、产酯酵母菌株。该菌株可以在酱油酿造高盐环境下生长繁殖，能产生醇厚、酯香的酱油风味，提高酱油品质。根据其形态特征、生理生化特征及其26S rRNA基因序列在Genbank中的检索结果，鉴定菌株A为鲁氏接合酵母iZygosaccharmyces rouxi1、。
[0007]本发明的目的是这样实现的:
一种高耐盐鲁氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J )菌株，已于2013年07月02日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2013310。
[0008]上述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株的26S rRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0009]本发明所提供的高耐盐鲁氏接合酵母A (.Zygosaccharomyces rouxii J)菌株具有以下形态特征:直径约5 μ m，球形，不运动，以出芽方式进行无性繁殖。在YEH)琼脂培养基上28 °C培养48h后，为乳白色，不透明，圆形菌落。[0010]本发明所提供的高耐盐鲁氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J)菌株的全细胞脂肪酸主要以油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸形式存在。在含盐培养基上培养，菌株A不饱和脂肪酸含量增加，其全细胞脂肪酸主要以油酸、亚油酸、棕榈油酸和棕榈酸形式存在。
[0011]根据耐盐性能实验结果，本发明所提供的高耐盐鲁氏接合酵母A{Zygosaccharomyces rouxii A )菌株的耐盐范围(以 NaCl 计)为 0_24%。
[0012]根据温度生长实验结果，本发明所提供的高耐盐鲁氏接合酵母AiZygosaccharomyces rouxii J )菌株的生长温度范围为:6_39°C。
[0013]本发明所述高耐盐鲁氏接合酵母A (.Zygosaccharomyces rouxii J )菌株在20%NaCl的YEH)培养基中培养产生的醇厚、酯香风味明显优于YETO培养基，用于酱油酿造可改善酱油风味，提高酱油品质。 [0014]本发明所述高耐盐鲁氏接合酵母A {Zygosaccharomyces rouxii J )菌株在YEF1D培养基28°C培养24h，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，生物学性状稳定。
[0015]与现有技术相比，本发明所述高耐盐鲁氏接合酵母rouxiiJ )菌株具有如下有益的技术效果:
(I)根据实施例3表2的食盐耐受性实验可以看出，本发明所述鲁氏接合酵母菌株在20%氯化钠存在情况下生长情况良好，在24%氯化钠存在情况下仍能保持一定的生长量，在26%氯化钠存在情况下仍能生长。这说明本发明的鲁氏接合酵母菌株食盐耐受性强，完全适合工业上高盐稀态酿造酱油生产中的应用。
[0016](2)本发明所述鲁氏接合酵母菌株在35°C下生长情况良好，在39°C仍能保持一定的生长量。这说明本发明的鲁氏接合酵母菌株具有一定的温度耐受性，适合工业上在高盐稀态酿造酱油生产中的应用。
[0017](3)根据实施例4，本发明所述鲁氏接合酵母菌株在含18%氯化钠的YEH)培养基28°C培养4d后，产生香气物质，具有较浓郁的醇厚、酯香风味。
[0018](4)本发明所述鲁氏接合酵母菌株由于耐盐性高，在高盐稀态酱油酿造中能缩短发酵周期，并产生醇厚、酯香的酱油风味，为酱油的工业生产提供了优良菌株。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明所述鲁氏接合酵母A在1000倍显微镜菌体形态图。
[0020]图2为本发明所述鲁氏接合酵母A基于26S rRNA基因发育树图。
【具体实施方式】
[0021]以下结合【具体实施方式】对本发明进行详细描述。实施例仅为举例说明，本发明的范围并不以具体实施方法为限，而是由权利要求的范围加以限定。
[0022]实施例1:本发明鲁氏接合酵母A的26S rRNA鉴定实验
酵母基因组DNA的提取和纯化利用Sambrook et al.(1989)方法。以提取并检测合格的染色体 DNA 为模板，选用 NL I (5’ -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’ )和 NL4(5，-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3’)作为引物，26s rRNA基因序列的PCR扩增按 Solieri L.etal.(2007)方法操作，基因序列测定由上海英骏公司完成。利用Clustalxl.8，MEGA 5.0软件(Tamura et al.2011)，根据26S rRNA基因序列相似度分析的结果，选取相关菌株的26SrRNA 基因序列,分别采用 neigbor-joining (邻位相接法，NJ) (Saitou and Nei 1987)算法得到相应的系统发育树(图2)。构建的系统发育树表明菌株A在Zygosaccharomyces属进化树一个分枝上,与Z /PoMii种的菌株在一个类群内而与其他种处于不同的分枝。说明菌株A属于鲁氏接合酵母iZygosaccharmyces rouxii)。
[0023]实施例2:本发明鲁氏接合酵母A全细胞脂肪酸组分特征分析实验
酵母繁殖时是依靠其细胞膜脂肪酸的饱和度来适应周围环境中的酒精、食盐、高温等不利因素的。为了分析菌株A的脂肪酸成分，首先将菌株A接种于YEH)肉汤中，28°C培养至对数生长期后期，收集适当菌体，根据《the protocol of the Sherlock MicrobialIdentification System (MIDI))) (version 6.0.)描述的方法提取菌体脂肪酸甲基化酯，最后用Agilent 6890N GC气相色谱通过MIDI Sherlock YEAST6数据库分析脂肪酸成分(Sasser，1990)。本发明所述菌株A全细胞脂肪酸组分如表1所示。菌株A全细胞脂肪酸主要以油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸形式存在。在含盐(18% NaCl)培养基上培养，菌株A不饱和脂肪酸含量增加，C18脂肪酸含量增加，其全细胞脂肪酸主要以油酸、亚油酸、棕榈油酸和棕榈酸形式存在。与现有鲁氏接合酵母在其高氯化钠浓度YEH)培养基上培养相t匕，菌株A的C18脂肪酸含量提高了 5%以上，不饱和脂肪酸含量提高了 10%以上。
[0024]表1菌A主要脂肪酸成分
【权利要求】
1.一种高耐盐鲁氏接合酵母A iZygosaccharomyces rouxii J)菌株,其保藏编号为CCTCC NO:M2013310o
2.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的26SrRNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根据权利要求1或2所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的直径约5 μ m,球形，不运动，以出芽方式进行无性繁殖，在YEH)琼脂培养基28°C培养48h后为乳白色、不透明的圆形菌落。
4.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的全细胞脂肪酸主要以油酸、棕榈酸、棕榈油酸和硬脂酸形式存在，在含盐培养基上培养，全细胞不饱和脂肪酸含量增加，其全细胞脂肪酸主要以油酸、亚油酸、棕榈油酸和棕榈酸形式存在。
5.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的氯化钠耐受浓度为0-24%。
6.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的葡萄糖耐受浓度为0-60%。
7.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的生长温度范围为6-39 °C。
8.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株的生长pH 范围为 4.0-7.0。
9.根据权利要求·1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株在含食盐的YEro培养基中培养，产生香气物质，具有较浓郁的醇厚、酯香风味。
10.根据权利要求1所述的高耐盐鲁氏接合酵母A菌株，其特征在于:所述菌株在YEro培养基30°C培养24h，连续传代数代培养，其培养特征及形态特征均无明显变化，生物学性状稳定。
【文档编号】C12R1/645GK103589651SQ201310362802
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年8月20日 优先权日:2013年8月20日
【发明者】陈雄, 代俊, 王志 申请人:湖北工业大学