核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
【专利摘要】本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸。本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该方法包括：（1）使用针对如上所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；（2）检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对产生的特异性目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所述转基因水稻EB7001S或者含有该核酸的衍生系。本发明还提供了一种试剂盒及该试剂盒的用途。通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻EB7001S或者含有该核酸的衍生系的检测。
【专利说明】核酸和检测转基因水稻EB7001S及其衍生系的方法以及试 剂盒及其用途
【技术领域】
[0001] 本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种核酸、一种检测转基因水稻的方 法、一种试剂盒以及该试剂盒在检测转基因水稻中的应用。
【背景技术】
[0002] 水稻（Oryza sativa L )作为世界上最重要的粮食作物之一，人们对其遗传转化 和育种利用等方面进行了深入细致的研究。我国在水稻转基因研究领域取得了一系列重大 成果，很多转基因水稻品种已被获准进行环境释放和生产性试验，2009年转Bt基因抗螟虫 水稻"华恢1号"和"Bt汕优63"获得生产应用安全证书，标志着我国转基因水稻具备了商 业化生产的基本条件。为了平衡贸易利益、满足公众关切、控制潜在风险、加强工商监管，许 多国家相继建立了转基因生物及其产品的安全评价和标识制度。我国现行对于农业转基因 生物的管理依据的是国务院2001年5月23日颁布的《农业转基因生物安全管理条例》，以 及农业部2002年1月5日发布的《农业转基因生物安全评价管理办法》、《农业转基因生物 进口安全管理办法》和《农业转基因生物标识管理办法》3个配套规章。为了实现对转基因 生物及其产品的标识管理，保障转基因产品的有效监管和转基因产业的健康发展，对转基 因检测技术的准确度和灵敏度提出了严格要求。
[0003] 国际农业生物技术应用服务组织（International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications, ISAAA)统计报告显不，2012年全球28个国家种植转基因 作物，种植面积达到1. 703亿公顷，比2011年的1. 6亿公顷增长了 6%。水稻是世界上最重 要的粮食作物之一，自第1批转基因水稻植株1988年问世以来，含有各种优良性状，如抗 虫、抗除草剂、抗菌、抗病毒或营养改良的转基因水稻相继研发成功。但各国对转基因水稻 的商业化生产态度谨慎，1999年美国批准了 2个抗除草剂转基因水稻品种LL62和LL06的 商业化种植，2004年伊朗开始规模化种植抗虫转基因水稻，2009年中国农业部批准了华中 农业大学的转Bt基因抗虫水稻华恢1号和Bt汕优63的生产应用安全证书，但至今还没有 获得品种审定，即商业化生产许可。
[0004] 转基因植物中外源基因在染色体上插入位置的旁侧序列是转基因植物品系最重 要的分子特征之一，是区别不同转化事件的唯一性标识，是建立转基因植物品系特异性检 测方法的重要技术资料。如：王恒波等(转基因大豆GTS40-3-2转化事件特异性PCR检测 [J].基因组学与应用生物学，2010,（06) :1177-83)建立了抗草甘膦转基因大豆GTS40-3-2 的品系特异性PCR检测方法。翟志芳等(转基因玉米LY038转化事件的特异性检测[J]. 农业生物技术学报，2011，（03) :577-82.)采用修饰接头连接PCR获得了转基因玉米LY038 的外源基因与玉米基因组之间的5'端侧翼序列，据此建立了转基因玉米LY038转化事件 特异性定性检测方法。就水稻而言，目前国内获得了转基因水稻克螟稻(转Xa21基因水 稻抗优97特异性检测方法的建立；中国植物病理学会2006年学术年会，中国湖南长 沙，F，2006[C] )、Bt汕优63 (CN101824411A)、科丰6号（转基因水稻Bt汕优63外源插 入结构验证和定量检测方法建立[D];中国农业科学院，2008)、两系早稻恢复系B2A68 (201310068126. 8 :核酸和检测转基因水稻B2A68及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途） 等的外源插入片段的旁侧序列，并建立了品系特异性的检测方法。
[0005] 利用密码子优化的Epspss基因和Bar基因共同转化水稻，可以获得抗两种除草剂 的水稻（参考专利申请201110270905. 7, CN102994526A)。既抗除草剂草甘膦，又抗除草剂 草铵膦的转基因水稻不育系不仅能方便除草，而且有利于实现机械化制种，还可以实现除 草剂的交替使用、有效降低由于长期使用一种除草剂而导致杂草产生抗性的风险。本发明 的发明人通过密码子优化的Epsps s基因和Bar基因转化水稻，获得了一个转基因水稻新品 系EB700IS。由于农杆菌转化水稻外源基因的插入具有随机性，转基因水稻品系EB700IS的 外源基因在基因组中插入位置并不清楚，因此，难以实现对转基因水稻品系EB7001S的特 异性检测。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种核酸及检测含有该核酸的转基因水稻品系的方法。
[0007] 转基因水稻新品系EB7001S已经在专利文献（CN102994526A)中公开，可以通过 向中国科学院亚热带农业生态研究所来函索取的方式获得，中国科学院亚热带农业生态研 究所保证从本发明的申请日起二十年内按照国家法规要求向公众发放转基因水稻新品系 EB7001S。
[0008] 由于外源基因的插入具有随机性，导致不同转化事件中，外源基因几乎没有机会 在水稻基因组的同一位置插入，因此，每个独立的转化事件都具有唯一性，所以外源基因序 列与水稻基因组序列拼接而成的旁侧序列也具有唯一性。因此，旁侧序列的核酸是一种全 新的核酸分子，本发明的发明人得到了转基因水稻品系EB7001S外源基因旁侧序列的具体 序列信息，由此建立的检测方法是检测转基因水稻品系EB7001S及含有该核酸衍生水稻系 的特异性方法。
[0009] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻 EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻EB7001S的旁侧序列为SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段，SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括 SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，优选至少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列， 更优选至少包括SEQ ID No. 1的第129-210位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，优选至少包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列， 更优选至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950位的序列。
[0010] 另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因 水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系，该方法包括：
[0011] (1)使用针对如上所述的核酸的特异性引物，对取自待测水稻的核酸样品进行PCR 扩增，得到PCR扩增后的产物；
[0012] (2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性 目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻 为所述转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂交产生的含有如上所述的核酸片段的衍生 系。
[0013] 另一方面，本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或 左侧特异性引物对，其中，所述右侧特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述左侧特异性引物对包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12 所示的核酸。
[0014] 另一方面，本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含 有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
[0015] 通过上述技术方案，本发明成功地实现了转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂 交产生的含有该核酸片段的衍生系的检测。
[0016] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具 体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0018] 图1为转基因水稻EB7001S所用载体的T-DNA区域结构及引物位置示意图。
[0019] 图2为转基因水稻EB7001S通过hiTail-PCR扩增得到的T-DNA右边界侧的旁侧 序列片段电泳图。M :1Kb plus DNA marker ;1:EB7001S的TAIL-PCR第2级扩增产物（弓丨 物对ACl/RB-lb) ;2 :EB7001S的TAIL-PCR第3级扩增产物（引物对ACl/RB-2b) ;3 :非转基 因对照7001S的TAIL-PCR第2级扩增产物（引物对ACl/RB-lb);4 :非转基因对照7001S的 TAIL-PCR第3级扩增产物（引物对ACl/RB-2b)。
[0020] 图3为通过LD-PCR方法获得的转基因水稻EB7001S中T-DNA左边界旁侧序列片 段回收后的电泳图。M :1Kb plus DNA marker ;1 :EB7001S基因组DNA的LD-PCR产物（引物 对 LB1-F/LB1-R)。
[0021] 图4为外源基因在水稻染色体上的插入位点及其上下游基因分布图。
[0022] 图5为转基因水稻EB7001S中T-DNA右边界侧的旁侧序列特异性引物对RB-F/ RB-R检测电泳图。M :1Kb plus DNA marker ;B :空白对照；1、3、5、7、9 :转基因水稻EB7001S、 CD083、B2A4008S、B2A68、B88S ;2、4、6、8 :非转基因对照 7001S、吉梗 88、4008S、D68。
[0023] 图6为转基因水稻EB7001S中T-DNA左边界侧的旁侧序列特异性引物对LB2-F/ LB2-R检测电泳图。M:150bp DNA Ladder ;1、3、5、7、9 :转基因水稻 EB7001S、CD083、 B2A4008S、B2A68、B88S ;2、4、6、8、10 :非转基因对照 7001S、吉梗 88、4008S、D68。P88S。
[0024] 图7为右边界特异性引物对退火温度优化结果。M :1Kb plus DNA marker ;1 : 51. 0 °C ；2 ：51. 3 °C ；3 ：52. I 〇C ；4 ：53. 2 °C ；5 ：54. 5 °C ；6 ：55. 8 °C ；7 ：57. 2 °C ；8 ：58. 5 °C ；9 ： 59. 8。。；10 :60· 9。。；11 :61· 7。。；12 :62. (TC。
[0025] 图8为左边界特异性引物对退火温度优化结果。M :1Kb plus DNA marker ;1 : 51. 0 °C ；2 ：51. 3 °C ；3 ：52. I 〇C ；4 ：53. 2 °C ；5 ：54. 5 °C ；6 ：55. 8 °C ；7 ：57. 2 °C ；8 ：58. 5 °C ；9 ： 59. 8。。；10 :60· 9。。；11 :61· 7。。；12 :62. (TC。
[0026] 图9为右边界特异性引物对灵敏度检测结果。M :150bp DNA Ladder ;CK:非转基 因对照700IS基因组DNA ; I, 2, 3 :100%转基因水稻EB700IS基因组DNA ;4, 5, 6 :20%转基因 水稻EB7001S基因组DNA ;7,8,9 :5%转基因水稻EB7001S基因组DNA ;10, 11, 12 :1%转基因 水稻 EB7001S 基因组 DNA ;13, 14, 15 :0. 5% 转基因水稻 EB7001S 基因组 DNA ;16, 17, 18 :0. 1% 转基因水稻EB7001S基因组DNA。
[0027] 图10为左边界特异性引物对灵敏度检测结果。M :150bp DNA Ladder ;CK :非转基 因对照700IS基因组DNA ;1，2, 3 :100%转基因水稻EB700IS基因组DNA ;4, 5, 6 :20%转基因 水稻EB7001S基因组DNA ;7,8,9 :5%转基因水稻EB7001S基因组DNA ;10, 11，12 :1%转基因 水稻 EB7001S 基因组 DNA，13, 14, 15 :0. 5% 转基因水稻 EB7001S 基因组 DNA ;16, 17, 18 :0. 1% 转基因水稻EB7001S基因组DNA。
【具体实施方式】
[0028] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0029] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸为转基因水稻 EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻EB7001S的旁侧序列为SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段，SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括 SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，优选至少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列， 更优选至少包括SEQ ID No. 1的第129-210位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，优选至少包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列， 更优选至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950位的序列。
[0030] 另一方面，本发明还提供了一种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因 水稻EB7001S或者含有如上所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系，该方法包括：
[0031] (1)使用针对如上所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进行 PCR扩增，得到PCR扩增后的产物；
[0032] (2)检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性 目的片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻 为所述转基因水稻EB7001S或者由EB7001S杂交产生的含有如上所述的核酸片段的衍生 系。
[0033] 根据本发明的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特异性引物对。所述针对SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特异性引 物对是指一条引物在SEQ ID No. 1的l-169bp区域设计，另一条引物在170-2071bp区域设 计，能够能扩增SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段所示的核酸、并产生特定大小目标条带 的引物对，所述针对SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特异性引物对不能够扩增SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段所示的核酸以外的核酸或者扩增不能产生特定大小的目标 条带。优选地，所述针对SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的 长度为485bp。
[0034] 根据本发明的方法，其中，当所述特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和 SEQ ID No. 10所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件可以包括退火温度为56-61°C(图 7)。
[0035] 根据本发明的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特异性引物对。所述针对SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特异性引 物对是指一条引物在SEQ ID No. 6的l-1909bp区域设计、另一条引物在1910-2671bp区域 设计，能够扩增SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段所示的核酸、并产生特定大小目标条带 的引物对。所述针对SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段的特异性引物对不能够扩增SEQ ID No. 6或SEQ ID No. 6的片段所示的核酸以外的核酸或者扩增不能产生特定大小的目标 条带。优选地，所述特异性引物对包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的 核酸；所述特异性引物对扩增的目的片段的长度为629bp。
[0036] 根据本发明的方法，其中，当所述特异性引物对包括SEQ ID No. 11所示的核酸和 SEQ ID No. 12所示的核酸时，优选情况下，PCR扩增的条件包括退火温度为52-62°C(图8)。 [0037] 当使用本发明提供的如上所述的特异性引物对对转基因水稻EB7001S及其衍生 系进行检测时，所述特异性引物对对转基因 EB7001S成分的最低检测限度可达到0. 5%。因 此，本发明提供的特异性引物对特别适用于对转基因水稻EB7001S及其衍生系的检测、监 测及标识制度管理。
[0038] 本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性 引物对，其中，所述右侧特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示 的核酸；所述左侧特异性引物对包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核 酸。
[0039] 根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性 对照核酸包括SEQ ID NO. 1所示的核酸和/或SEQ ID NO. 6所示的核酸。
[0040] 根据本发明的试剂盒，其中，优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和耐高 温DNA聚合酶。
[0041] 本发明还提供了如上所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含有如上所 述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
[0042] 转基因水稻EB7001S所用载体的T-DNA区域结构及引物位置见图1，该载体由 Epspss基因表达框和Bar基因表达框组成。本发明采用常规方法提取植物基因组DNA。利 用hiTail-PCR和LD-PCR的方法，扩增、分离并延伸得到外源基因插入位点的右旁侧序列， 如SEQ ID No. 1所示，长度2071bp。利用LD-PCR方法分离得到的外源基因插入位点的左旁 侧序列，如SEQ ID No. 6所示，长度267 Ibp。
[0043] 通过分析SEQ ID No. 1发现，其中第1至第169位序列与所用载体右边界上游序 列完全一致，说明是外源基因序列，第170至第2071位序列与已发表的水稻基因组第7号 染色体上序列（NCBI【http://www. ncbi. nlm. nih. gov】登录号 AP006451. 3)的第 88469 至 第90370位匹配，说明是受体水稻7001S自身的基因组序列。通过分析SEQ ID No. 6发现， 其第1至第1909位序列与水稻第7号染色体上的序列（AP006451. 3)完全一致，说明该段 序列来源于受体7001S的基因组序列，第1910至第2671位与载体左边界及CaMV35S终止 子、Bar基因序列及35S启动子部分序列完全相同，说明该段序列来自外源基因。
[0044] 根据T-DNA右旁侧序列（SEQ ID No. 1)设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQ ID No. 1中第1至第169位序列设计，即是按照T-DNA右边界上游区域序列设计，另一条引 物根据第170至第2071位序列设计，即按照插入位点处的水稻基因组序列设计。即该引物 对能够特异性的扩增出具有部分外源基因序列和水稻基因组第7号染色体上序列的特异 序列。优选的，本发明采用的正向引物为RB-F，序列如SEQ ID No. 9所示，反向引物为RB-R， 序列如SEQ ID No. 10所示，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻EB7001S能获得 长度为485bp的特异条带（图5)。引物对RB-F/RB-R对样品中转基因水稻EB7001S的成分 的检测限度达到0.5% (图9)。
[0045] 根据T-DNA左旁侧序列（SEQ ID No. 6)设计特异性引物对，其中一条引物根据SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列设计，即参照插入位点旁边的水稻基因组序列设计，另一条 引物根据第1910至第2671位序列设计，即按照T-DNA左边界上游序列设计。优选的，本发 明采用的正向引物为LB2-F，序列如SEQ ID No. 11所示，反向引物为LB2-R，序列如SEQ ID No. 12所示，利用该引物对进行PCR检测，只有转基因水稻EB7001S能获得长度为629bp的 特异条带（图6)。引物对LB2-F/LB2-R对样品中转基因水稻EB7001S的成分的检测限度达 到 0· 5% (图 10)。
[0046] 本发明首次获得了转基因水稻品系EB7001S的插入外源基因的左、右旁侧序列 (外源基因在水稻染色体上的插入位点及其上下游基因分布如图4所示)，并且利用这两个 旁侧序列建立了灵敏高、特异性强的转基因水稻EB7001S的品系特异性定性PCR检测方法。 本发明所建立的转基因水稻EB7001S特异性PCR检测方法可以进一步应用于特异性检测试 齐?盒的开发，以对转基因活体Ot株、种子)、产品、提取物进行转基因成分的定性检测，通过 标准含量样品的设置，还可实现定量检测和定量检测试剂盒的开发。
[0047] 本发明可以采用如下技术方案：
[0048] 1)获得右旁侧序列
[0049] 转基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色体插入位置的右旁侧序列，所述 T-DNA右边界侧的右旁侧序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0050] 首先，通过hiTail-PCR扩增得到转基因水稻EB7001S右旁侧部分序列，如SEQ ID 此.2所示，全长15156?。11^&11-?0?所用特异性嵌套引物依据植物表达载体？033004?邓 8 的T-DNA序列右边界（RB)上游IacZ基因序列设计。植物表达载体pC3300-EpSps的资料 参考专利（201110270905. 7)。hiTail-PCR方法参考文献（Liu et al·，2007, BioTechnique s，43 (5) : 649-456)，其中：所述引物包括长随机引物LADl-LAD4,通用引物ACl，特异性嵌套 引物Rb-〇b、Rb-Ib和Rb-2b (引物序列见表1)。hiTail-PCR扩增获得1515bp长的片断。
[0051] 通过BLAST分析发现其中第1至第169位核苷酸序列与所用载体右边界序列完 全一致；第170至第1515位序列与水稻基因组第7号染色体上（AP006451. 3)的序列的第 88469至第89820位高度匹配。
[0052] 其次，根据获得的水稻基因组序列信息（AP006451. 3)设计引物对RBG-F/RBG-R， 序列如SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示，利用RBG-F和RBG-R引物对进行PCR扩增得到 647bp的转基因水稻EB7001S的基因组序列，如SEQ ID No. 5所示，该段序列多次测序结果 均与NCBI数据库所公布的水稻基因组序列（AP006451. 3)完全一致。
[0053] 分析SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5序列发现二者有9 Ibp的序列重叠，将两次扩增 获得的两个序列SEQ ID No. 2和SEQ ID No. 5拼接得到右旁侧序列SEQ ID No. 1，该序列全 长2071bp，包含第1至第169位的外源基因序列（载体序列）与第170至第2071位的水稻 基因组序列。
[0054] 2)获得左旁侧序列
[0055] 在本发明中，还提供了转基因水稻EB7001S的外源基因在水稻染色体插入位置的 左旁侧序列，所述T-DNA左边界侧的左旁侧序列如SEQ ID No. 6所示。
[0056] 所述左旁侧序列，如SEQ ID No. 6所示，它通过LD-PCR扩增得到，全长2671bp。具 体方法为：根据测序所得的右边界序列以及已公布的水稻第7号染色体上的序列设计正向 引物LB1-F，序列如SEQ ID No. 7所示，根据载体pC3300-Epsps序列设计反向引物LB1-R， 序列如SEQ ID No. 8所示，用该引物对扩增获得转基因水稻EB7001S的左旁侧序列，如SEQ ID No. 6所示，长度为2671bp。通过分析SEQ ID No. 6发现，获得的序列第1至第1909位 与水稻基因组第7号染色体上部分序列（NCBI登录号AP006451. 3上88465-90374位)完全 匹配，第1910位至第2671位与载体pC3300_Epsps的CaMV35S终止子部分序列完全相同。 接合处水稻基因组序列缺失3bp。
[0057] 3)基于右旁侧序列的EB7001S转化事件特异性检测方法
[0058] 转基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的右旁侧序列的定性PCR检测方法，其 中，所述PCR反应中的两条引物组合为T-DNA右边界的旁侧序列的特异性引物对：一条引物 依据SEQ ID No. 1中第1至第169位序列设计，另一条引物依据SEQ ID No. 1中第170至 第2071位序列设计。
[0059] 优选地，所述特异性引物对如下：
[0060] 正向引物RB-F，序列如SEQ ID No. 9所示，依据SEQ ID No. 1中第1至第169位序 列设计；
[0061] 反向引物RB-R，序列如SEQ ID No. 10所示，依据SEQ ID No. 1中第170至第2071 位序列设计；
[0062] 利用上述引物对进行PCR扩增，转基因水稻品系EB7001S能获得长度为485bp的 目的片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或不能获得大小 相同的目的片断。
[0063] 4)基于左旁侧序列的EB7001S转化事件特异性检测方法
[0064] 转基因水稻品系EB7001S的外源插入片段的左旁侧序列的定性PCR检测方法，其 中，所述PCR反应中的两条引物组合为外源基因插入位点处左旁侧序列的特异性引物对： 一条引物依据SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列设计，即插入位点处水稻基因组序列； 另一条引物依据SEQ ID No. 6中第1910至第2671位序列设计，S卩外源基因序列。
[0065] 优选地，所述特异性引物对如下：
[0066] 正向引物LB2-F，序列如SEQ ID No. 11所示，依据SEQ ID No. 6中第1至第1909 位序列设计；
[0067] 反向引物LB2-R，序列如SEQ ID No. 12所示，依据SEQ ID No. 6第1910至第2671 位序列设计；
[0068] 利用上述引物对进行扩增，转基因水稻品系EB7001S能获得长度为629bp的目的 片段，非转基因水稻及非该转化事件的转基因水稻不能获得目的片断或不能获得大小相同 的目的片断。
[0069] 5)基于左、右旁侧序列的多重PCR检测方法
[0070] 依据SEQ ID No. 1中第1至第169位序列设计一条特异性引物，依据SEQ ID No. 1 中第170至第2071位序列设计一条特异性引物，获得右旁侧序列的特异性引物对；依据SEQ ID No. 6中第1至第1909位序列设计一条特异性引物，依据SEQ ID No. 6中第1910至第 2671位序列设计一条特异性引物，获得左旁侧序列的特异性引物对；以这两个特异性引物 对同时扩增转基因水稻基因组DNA，同时获得左、右边界的两条目标特异带。
[0071] 优选的，以特异性引物LB2-F、LB2-R、RB-F和RB-R对待测样品DNA进行PCR扩增， 转基因水稻EB7001S扩增获得629bp和485bp的2条目的片段，其它所有水稻不会获得条 带或者上述相同大小的目标条带。
[0072] 以下，通过实施例进一步详细说明本发明，下列实施例中未注明具体条件的试验 方法，按照常规条件进行，例如《分子克隆：实验室手册》中所述的条件，或按照相应生物学 试剂的制造厂商所建议的条件。
[0073] 实施例1 :转基因水稻品系EB7001S右边界旁侧序列的扩增
[0074] I) DNA 的提取
[0075] CTAB法(王关林等，植物基因工程，北京：科学出版社，2009)。取2. OyL的DNA，用 1. 〇%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，并用微量紫外分光光度计测定DNA浓度。
[0076] 2) hiTaiI-PCR 分离 T-DNA 右旁侧序列
[0077] 参照 Liu 等（Liu et al.，2007, BioTechniques, 43 (5) :649-456)的方法进行。 hiTail-PCR第1级反应使用4条长随机引物（LAD1-LAD4)与特异性嵌套引物Rb-Ob组合， 以基因组DNA为模板进行PCR扩增，非转基因水稻7001S作为对照。第1级PCR扩增反应 产物稀释40倍用作第2级Tail-PCR反应的模板，第2级反应的引物组合为ACl/RB-lb。将 第2级反应产物稀释10倍用作第3级反应的模板，引物组合为ACl/RB-2b。第二级和第三 级反应的扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离。所用引物序列见表1，扩增程序见表2。
[0078] 表 I :hiTail_PCR 所用引物
[0079]
【权利要求】
1. 一种核酸，该核酸为转基因水稻EB7001S的旁侧序列的核酸，所述转基因水稻 EB7001S 的旁侧序列为 SEQ ID No. 1 或 SEQ ID No. 1 的片段，SEQ ID No. 6 或 SEQ ID No. 6 的片段；其中，SEQ ID No. 1的片段至少包括SEQ ID No. 1的第149-190位的序列，优选至 少包括SEQ ID No. 1的第139-200位的序列，更优选至少包括SEQ ID No. 1的第129-210 位的序列；SEQ ID No. 6的片段至少包括SEQ ID No. 6的第1889-1930位的序列，优选至少 包括SEQ ID No. 6的第1879-1940位的序列，更优选至少包括SEQ ID No. 6的第1869-1950 位的序列。
2. -种检测转基因水稻的方法，该转基因水稻为转基因水稻EB7001S或者含有权利要 求1所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生水稻，该方法包括： (1) 使用针对权利要求1所述的核酸的特异性引物对，对取自待测水稻的核酸样品进 行PCR扩增，得到PCR扩增后的产物； (2) 检验所述PCR扩增后的产物中是否含有所述特异性引物对扩增产生的特异性目的 片段；如果所述PCR扩增后的产物中含有所述特异性目的片段，则指示所述待测水稻为所 述转基因水稻EB7001S或者含有权利要求1所述的核酸的衍生系。
3. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No. 1或SEQ ID No. 1的片段的特异性引物对，该引物对中的一条引物在SEQ ID No. 1的l-169bp区域 设计、另一条引物在SEQ ID No. 1的170-2071bp区域设计；所述特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的 长度为485bp。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括，退火温度为56-61 °C。
5. 根据权利要求2所述的方法，其中，所述特异性引物对包括针对SEQ ID No. 6或 SEQ ID No. 6的片段的特异性引物对，该引物对中的一条引物在SEQ ID No. 6的l-1909bp 区域设计、另一条引物在1910_2671bp区域设计；所述特异性引物对包括SEQ ID No. 11所 示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核酸；所述特异性引物对扩增产生的目的片段的长度为 629bp〇
6. 根据权利要求5所述的方法，其中，PCR扩增的条件包括，退火温度为52-62°C。
7. -种试剂盒，该试剂盒包括右侧特异性引物对和/或左侧特异性引物对，其中，所述 右侧特异性引物对包括SEQ ID No. 9所示的核酸和SEQ ID No. 10所示的核酸；所述左侧特 异性引物对包括SEQ ID No. 11所示的核酸和SEQ ID No. 12所示的核酸。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性对照核酸，所述阳性对 照核酸包括SEQ ID No. 1所示的核酸和/或SEQ ID No. 6所示的核酸。
9. 根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括dNTPs、PCR缓冲液和 耐高温DNA聚合酶。
10. 权利要求7-9中任意一项所述的试剂盒在检测转基因水稻EB7001S或者含有权利 要求1所述的核酸的转基因水稻EB7001S的衍生系中的用途。
【文档编号】C12Q1/68GK104419708SQ201310362525
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】肖国樱, 魏岁军, 邓力华 申请人:中国科学院亚热带农业生态研究所