重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及该蛋白抗体的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及其重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，属于生物科学和运载蛋白【技术领域】重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法包括以下步骤：NGAL抗原表位的分析；重组NGAL的合成；重组NGAL的分离纯化；制备兔抗重组NGAL蛋白抗体；收集、分离得到含有抗体的抗血清，纯化抗体，即得到抗NGAL蛋白抗体。采用该制备方法解决了天然全长蛋白制备多抗产量低的问题，同时采用本发明的制备工艺制备的抗体其特异性良好，解决了现有的中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体不能全部满足用于免疫印迹、免疫组织化学实验和酶联免疫吸附实验的问题。
【专利说明】重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及该蛋白抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物科学和运载蛋白【技术领域】，特别涉及一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白及其重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]中性粒细胞明13父酶相关脂质运载蛋白(NGAL)又称人脂质运载蛋白2或曬铁蛋白，是1993年由Kjeldsen等人在中性粒细胞中首先发现的。在生理状态下，中性粒细胞、肾小管上皮细胞、肺泡巨噬细胞、支气管上皮黏液细胞等分泌少量NGAL，而脑和周围神经、结肠、子宫和卵巢、胎盘、甲状腺等组织细胞中NGAL的表达呈阴性。
[0003]NGAL的生理功能尚不完全清楚，可能参与不同的生理、病理过程，涉及胚胎发育、细胞分化、肿瘤的发生发展、细胞凋亡、炎症免疫应答、脂质代谢等。在胚胎期，NGAL发挥类似生长因子的作用，参与各类组织发育、生长及分化，促进乳腺癌、食管癌等肿瘤细胞增殖。NGAL与MMP-9以二硫键形成12500bp的复合物，延长MMP的蛋白水解活性，促进MMP-9对细胞基底膜的降解，从而侵润周围基质，介导癌细胞转移。过去研究认为，NGAL促进细胞凋亡，但近年来研究发现NGAL还是一类应激蛋白，在外界有害物质刺激下，细胞分泌NGAL是一种机体自身防御机制，使组织细胞免于凋亡。NGAL还是一类新的急性期反应蛋白，作为介导铁离子像胞内运输的新型载体，通过竞争性夺取螯合物中的铁来阻止细菌对铁的吸收，从而抑制细菌生长。
[0004]近年研究发现，NGAL与急性肾损伤(acute kidney in jury, AKI)及各种原因引起的CKD密切相关，是预测AKI的一个新型标记物，同时也是监测CKD进展和肾功能损害的生物学指标，从而为CKD的临床诊断与治疗检测找到了新的方法。
[0005]鉴于NGAL具有诊断意义，目前有很多公司研发和生产了 NGAL体外诊断试剂盒。2005年由丹麦的BioPorto公司首先推出了 NGAL的ELISA商品检测试剂盒，可用于血清、血浆、尿液等样本中的NGAL检测。到现在已经有多家公司在国家食品药品监督管理局以及美国FDA注册了 NGAL检测试剂盒，其检测方法都是基于免疫分析方法。在这些检测产品的开发过程中抗体是试剂盒制备必不可少的原料。但是现有的这些抗体的特异性和灵敏度较差，表达蛋白的序列多选用全长序列，全长序列其表达产量低，容易导致制备多抗量不足，从而限制该检测指标试剂盒的开发及大规模的推广和应用，影响试剂盒的品质。因此研究开发高品质的抗体对试剂盒的性能及该指标检测的推广应用有着至关重要的作用。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为解决上述问题而提供了一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白以及适用于作为NGAL试剂盒的抗体的制备方法。
[0007]本发明所采用的技术方案是:
[0008]一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，该蛋白的基因序列为序列表中SEQ ID N0.1 所述。
[0009]一种要求重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，包括以下步骤:
[0010](I)重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL抗原表位分析:通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白重组表达，所述目的片段为序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白质序列；
[0011](2)重组NGAL的合成:将选定的目的片段通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转座，最后转染宿主细胞，病毒在复制的同时，目的蛋白也将得到表达；
[0012](3)重组NGAL的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化；
[0013](4)制备兔抗重组NGAL抗体:用步骤(3)纯化后的重组NGAL作为抗原去免疫兔子,得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。
[0014]进一步地，所述步骤(4)后，对抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组NGAL抗体干粉。
[0015]进一步地，所述NGAL蛋白质序列的引物f目息为:
[0016]上游引物:5’TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3’(SEQ ID N0.2)
[0017]下游引物:5’GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3’ (SEQ ID N0.3)。
[0018]优选地，所述步骤(2)中表达载体选自为pFastBacTMl、pFastBacTM ΗΤΑ、pFastBacTM HTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
[0019]优选地，所述步骤(2)中转染的宿主细胞为昆虫细胞系，所述昆虫细胞系为昆虫sf9细胞系。
[0020]进一步地，所述步骤(3)中蛋白提取为:收集培养的细胞系，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲溶液溶解；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上处理一段时间；将反应体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，后过0.22 μ m的滤膜；蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱；后用NiS04洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲溶液pH值相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组NGAL纯度。
[0021]进一步地，所述步骤(4)兔抗重组NGAL抗体的制备为:取重组NGAL与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组NGAL与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，静脉采血，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。
[0022]优选地，所述步骤(4)可以采用羊来制备羊抗重组NGAL抗体。
[0023]进一步地，所述抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化为:1)制备NGAL亲和层析柱:将NGAL蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合,依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到NGAL亲和层析柱；2)亲和层析:将NGAL抗体溶液通过I)所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；3)抗体获取:将2)收集解吸液，透析，冷冻干燥，得到NGAL抗体干粉。[0024]本发明具有以下优点:
[0025]本发明通过对NGAL的免疫原性分析，把两端没有免疫原性的位点去掉，同时采用昆虫表达系统对选定的序列进行表达，重组NGAL的表达量会大幅度提闻，同时制备的多抗量充足，适合用做诊断试剂原料的开发。同时，采用昆虫细胞系表达重组NGAL，相较于大肠杆菌表达系统而言，昆虫细胞系表达系统可以对重组蛋白进行翻译后修饰，使其特性与天然蛋白更接近，保证了制备出来的抗体能特异性的识别和结合样本中的天然NGAL蛋白。另外，昆虫细胞的内源性蛋白与人类蛋白同源性极低，即可以保证蛋白的翻译后修饰又能避免抗体的特异性差。采用本发明的方法制备出来的抗体可以非常好的用作诊断试剂的原料。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例得到的重组NGAL与对比实验制备的NGAL表达量对比的SDS-PAGE 胶图；
[0027]图2为本发明实施例制备的重组NGAL抗体与对比实验制备的NGAL抗体特异性实验对比的Western Blot结果图。 【具体实施方式】
[0028]下面结合附图和实施方式对本发明做进一步详细的说明。
[0029]实施例1
[0030]一、重组NGAL的表达
[0031]1.克隆序列表中SEQ ID N0.1的序列，其采用的引物为:
[0032]上游引物:5’TACGGGATCCGCCCTGTTGGGGGCTCTGCATG3’(SEQ ID N0.2)
[0033]下游引物:5’GCTAGTCGACGCCGTCGATACACTGGTCG3’(SEQ ID N0.3)
[0034]用此引物对体外扩增出序列SEQ ID N0.1中的重组NGAL片段序列。
[0035]2.将扩增的SEQ ID N0.1中的重组NGAL片段插入到表达载体pFastBacTM Dual。首先用BamHI和SalI对pFastBacTM Dual质粒进行消化处理，使其暴露出可以与NGAL片段进行碱基互补配对的黏性末端，然后在连接酶的作用下形成完整的环状质粒。后将环状质粒转化到大肠杆菌DH5 α中。
[0036]3.质粒验证。在得到Amp抗性转化株后，挑取10个转化株，在含有100 μ g/mL Amp的LB培养基中过夜培养，抽提质粒，使用BamHI和SalI消化处理质粒DNA。通过琼脂糖凝胶电泳分析重组质粒是否插入正确的位点，同时用PCR方法对阳性转化株进行分析，最后，将找到的阳性重组子进行测序，验证转化质粒的正确性。
[0037]4.重组杆粒克隆的制备。提取阳性重组子的质粒DNA，并将其转化进入DHlOBacTMEcoli，转变为杆粒。利用蓝/白斑法筛选出含有重组杆粒的克隆。在LB培养集中培养含有重组杆粒的大肠杆菌，抽提重组杆粒，并冻干保存，备用。
[0038]5.昆虫细胞sf9的转染以及杆状病毒粒子的收集。①sf9细胞计数，取12.5cm2新细胞培养瓶，每瓶加入9 X 105个细胞，并以全培培养12-24h，使细胞贴壁；②溶解2 μ g纯化重组杆状病毒重组质粒于100 μ L无添加成分的Grace’s Medium中将转染试剂充分摇匀后，取10 μ L加入100 μ L无添加成分的Grace’s Medium中，混匀；@将②和③所得溶液混匀，室温孵育30min，同时以2mL含10%FBS的Grace’s Medium洗涤待转化的细胞并弃去洗漆液；⑤取0.8mL无添加成分的Grace’ s Medium加入④所得质粒于转染剂的混合液中，轻轻混匀，总体积约lmL，加入④步洗涤完成的待转化的细胞中，27°C继续培养5h移除质粒、转染试剂混合物，加入2mL含10%FBS的Grace’s Medium，27°C孵育，直至病变现象产生；⑦5天后，IOOOrpm离心IOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光保存。由于昆虫细胞表达系统具有突出的优点:表达水平高、易于放大、生产的蛋白带有适当的翻译后修饰，而且细胞生长条件简单等优势。本发明通过研究发现采用昆虫细胞表达系统表达的重组NGAL其特性与天然蛋白更接近，且蛋白表达产量高。
[0039]6.杆状病毒病毒粒子的扩增及重组NGAL蛋白的表达。①取适当体积的杆状病毒粒子原液加入到汇聚度90%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；②去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含Medium,27°C恒温培养箱中恒温培养3天后，IOOOrpm离心IOmin收集细胞培养液中的病毒粒子，转移上清液到冻干管中，贴上标签，置于4°C冰箱中避光存放；④得到的病毒粒子可重复上述①-③步骤，以获得更高滴度的病毒粒子；⑤加入高滴度的杆状病毒病毒粒子到汇聚度达95%的新鲜传代的sf9细胞中，27°C恒温培养箱中，静置lh，每隔15min轻轻晃动一次；⑥去掉培养瓶中的培养液，加入新鲜的含10%FBS的Grace’ s Medium，27°C恒温培养箱中恒温培养?’⑦40-44h后，轻轻倒尽细胞上清培养液，加入预冷的细胞裂解液，冰上静置30min ;⑧收集细胞裂解液，加入等体积的2 X SDS凝胶加样缓冲液上样缓冲液，混匀，100°C保持IOmin SDS-PAGE检测蛋白质的表达情况。
[0040]二、蛋白的分离纯化
[0041]本实施例中重组NGAL的分离纯化包括蛋白质的提取和蛋白质纯化两个部分，分别如下:
[0042]1.蛋白质提取。①采用上述“重组NGAL蛋白的表达”方法在昆虫细胞系统中表达重组NGAL蛋白；②收集细胞 培养液，倒入500mL离心管中，于8000rpm离心30min，弃上清；③向细胞中加入PH8.0的NTA-O缓冲液，以每2L细胞培养液加入IOOmL缓冲液计向③步的反应体系中加入一定量的溶菌酶混匀，溶菌酶的用量为1:200，后置于冰上30min;⑤将上述反应体系倒入50mL烧杯内，于冰上超声波处理，超声波处理方式为:工作时间3S，间隔时间4S，如此重复99次，超声波的功率小于200W 将超声波处理完成的样本于16000rpm离心30min,保留上清；⑦将上清于16000rpm,4°C,离心20min 将离心完成的上清过0.22 μ m微孔滤膜。
[0043]2.蛋白质纯化。①取Ni柱流干，后用水洗3-5个柱体积，再用0.1M的EDTA溶液洗3个柱体积，之后再用水洗3-5个柱体积，然后再用pH8.0的NTA-O缓冲液洗3个柱体积，之后再用0.1M NiS04溶液洗5个柱体积并流干；②用pH4.2的0.2M醋酸钠平衡液洗3个柱体积，之后再用PH8.0的NTA-O缓冲液洗柱子，直到流出液与洗脱液的pH —致时，停止洗脱；③用lmL/min的流速将提取的蛋白质溶液上柱子上样完成后用pH8.0的NTA-O缓冲液洗柱子至G250不变蓝为止；⑤后分别用20mM、60mM、200mM和500mM的咪唑溶液洗脱柱子，直至检测G250不变蓝为止，洗脱过程中分别收集流出的液体，并将液体测定浓度后冷冻干燥既得重组NGAL蛋白干粉。[0044]三.抗体制备
[0045]用分离纯化得到的蛋白质免疫兔子，制备抗重组NGAL多克隆抗体，具体的操作流程如下:①准备2月龄、体重1.5±0.5kg的雄性健康新西兰大白兔，随机分组，待免疫。免疫前一周，分别于耳静脉采血留作阴性对照取一定量重组NGAL蛋白粉末用无菌PBS缓冲液配制成浓度为lmg/mL溶液，并与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后注射免疫事先准备好的大白兔，注射量为0.5mg/只首次免疫注射后第二周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫一次，免疫所有的试剂为lmg/mL重组NGAL蛋白PBS缓冲液于等体积不完全弗氏佐剂混合,加强免疫注射量为0.5mg/只，共免疫六次，至第三次免疫开始，每次免疫7-10天后耳静脉采血,并用Western Blot实验验证抗体的特异性。
[0046]四.抗重组NGAL抗体分离纯化
[0047]抗体分离纯化主要包括以下几个步骤:①NGAL亲和层析柱的制备:将NGAL蛋白(购自R&D公司)与压积CNBr_Sepharose4B (Pharmacia产品)按照5_7mg/mL比例混合，4摄氏度摇动18小时，使其交联。然后用0.lmol/L pH8.0碳酸盐缓冲液清洗3此，加等量0.lmol/L乙醇胺-HC14摄氏度摇动I小时，以封闭残留的活化基团。最后用0.0lmol/LTris-HCl(TB)清洗、装柱、平衡，柱子的容积选用IOmL ;②亲和层析:将制备得到的兔多抗血清以IOmL/小时流速通过步骤①制备的亲和层析柱、依次用lmol/L NaCl-TB,
0.5%NP-40-TB、TB和双蒸水清洗，以去除非特异性吸附。然后用3mol/L KSCNlOmL/小时进行解吸。紫外检测分段收集解吸液。③抗体获取:将②收集解吸液，透析，冷冻干燥，既得NGAL抗体干粉。
[0048]对比实验:
[0049]对比实验中采用NGAL全长序列序列，其余步骤和上述步骤系一致。从图1中可以看出采用本发明的方法，利用昆虫表达系统截断表达NGAL片段其制备的重组蛋白的量明显高于对比实施例，重组的重组蛋`白量非常有利于后期抗体的制备。图1中A为对比实施例，B为本实施例。
[0050]从图2中可以看出，采用本发明的方法制备的抗体其特异性要明显优于对比实施例所制备的抗体，这就保证了采用本发明的方法所制备出来的抗体能适用于各种实验过程。图2中A为本实施例制备的抗体，B为对比实施例制备的抗体。
[0051]实施例2
[0052]该实施例与实施例1不同的是抗体制备步骤与实施例1不同。其抗体制备步骤为:
[0053]抗体制备
[0054]用分离纯化得到的蛋白质免疫山羊，制备抗重组NGAL多克隆抗体，具体的操作流程如下:①雄性健康青壮波尔山羊，体重15KG以上，随机分组，待免疫。免疫前一周，分别于颈静脉采血留作阴性对照取一定量重组NGAL蛋白粉末用无菌PBS缓冲液配制成浓度为lmg/mL溶液，并与等量的弗氏完全佐剂充分乳化后注射免疫事先准备好的大白兔，注射量为0.6-0.Smg/只；③首次免疫注射三周后进行一次加强免疫注射，以后每隔三周加强免疫一次，免疫所有的试剂为lmg/mL重组NGAL蛋白PBS缓冲液于等体积不完全弗氏佐剂混合,加强免疫注射量为0.6mg/只，共免疫六次，至第四次免疫开始,每次免疫7-10天后颈静脉采血，并用Western Blot实验验证抗体的特异性。[0055]对比实验:
[0056]对比实验中采用NGAL全长序列，其余步骤和上述步骤系一致。
[0057]从实验结果可知，采用本发明的方法制备的重组蛋白的量要明显多于对比实施实验，且制备得到的抗体其特异性也优于对比实验，保证采用本发明所制备出来的抗体能充分满足各种实验的需求。
[0058]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
【权利要求】
1.一种重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，其特征在于，该蛋白的基因序列为SEQ ID N0.1 所示。
2.一种要求I所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白NGAL抗原表位分析:通过抗原表位分析选择目的片段用作蛋白重组表达，所述目的片段为序列表中SEQ ID N0.1所述蛋白质序列； (2)重组NGAL的合成:将选定的目的片段通过PCR扩增后插入到表达载体，然后进行转座，最后转染宿主细胞，病毒在复制的同时，目的蛋白也将得到表达； (3)重组NGAL的分离纯化:采用Ni柱纯化，包括蛋白提取和蛋白纯化； (4)制备兔抗重组NGAL抗体:用步骤(3)纯化后的重组NGAL作为抗原去免疫兔子，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。
3.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)后，对抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化，得到抗重组NGAL抗体干粉。
4.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述NGAL蛋白质序列的引物信息为SEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。
5.根据权利要求2所述的 重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于,所述步骤(2)中表达载体选自为pFastBacTM UpFastBacTM HTA、pFastBacTMHTB、pFastBacTM HTC 和 pFastBacTM Dual。
6.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中转染的宿主细胞为昆虫细胞系，所述昆虫细胞系为昆虫sf9细胞系。
7.根据权利要求2或6所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白提取为:收集培养的细胞系，离心弃上清；沉淀细胞用NTA-O缓冲溶液溶解；向缓冲体系中加入溶菌酶，置冰上处理一段时间；将反应体系倒入烧杯中于冰上超声处理；后用离心机离心取上清再离心一次，后过0.22 μ m的滤膜；蛋白纯化为:取Ni柱流干，后水洗Ni柱；用EDTA溶液洗涤Ni柱；再用水洗Ni柱；用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱；后用NiS04洗涤Ni柱，流干；再用NTA-O缓冲溶液洗涤Ni柱至流出液与NTA-O缓冲溶液pH值相同；以lmL/min速度上样；用NTA-O缓冲溶液洗涤至G250不变蓝为止；后用20mM、60mM、200mM和500mM咪唑溶液洗柱子，直至检测G250不变蓝为止，分别收集流出液体，跑胶分析溶液中重组NGAL纯度。
8.根据权利要求2所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)兔抗重组NGAL抗体的制备为:取重组NGAL与等体积的完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，首次免疫注射后第2周进行一次加强免疫注射，以后每隔两周加强免疫注射一次，每次加强免疫注射剂量与首次免疫注射剂量相同，加强免疫时取重组NGAL与等体积的不完全弗氏佐剂充分乳化后在兔背部皮下注射，注射量为500 μ g/只，静脉采血，得到含抗重组NGAL抗体的抗血清。
9.根据权利要求8所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)可以采用羊来制备羊抗重组NGAL抗体。
10.根据权利要求3所述的重组中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体的制备方法，其特征在于，所述抗重组NGAL抗体的抗血清进行分离纯化为:I)制备NGAL亲和层析柱:将NGAL蛋白与压积CNBr-Sepharose4B混合,依次经过交联、清洗、封闭、再次清洗、装柱、平衡，得到NGAL亲和层析柱；2)亲和层析fNGAL抗体溶液通过I)所制备的亲和层析柱，去除非特异性吸附后进行解吸，分段收集解吸液；3)抗体获取:将2)收集解吸液，透析，冷冻干燥，得到 NGAL抗体干粉。
【文档编号】C12N15/12GK103451187SQ201310362187
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2013年8月19日
【发明者】华权高, 刘瑾, 易汪雪, 闫彩霞, 马峰, 沈鹤霄, 舒芹 申请人:武汉华美生物工程有限公司