精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及方法
【专利摘要】本发明涉及蛋白表达领域，特别涉及精氨酸在提高发酵培养含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。该方法通过向发酵培养基或培养液中添加精氨酸，为细胞表达蛋白提供前体物质，从而使重组蛋白产量得到提高。本发明提出在发酵培养基或培养液中加入定量的精氨酸，从而显著提高重组细胞表达外源蛋白的产量，可提高36%及以上。
【专利说明】精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及方法
[0001]本申请要求于2012年08月17日提交中国专利局、申请号为201210295925.4、发
明名称为“精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及方法”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
【技术领域】
[0002]本发明涉及蛋白表达领域，特别涉及精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。
【背景技术】
[0003]精氨酸，学名为2-氨基-5-胍基-戊酸，是一种脂肪族的碱性的含有胍基的极性α氨基酸，在生理条件下带正电荷。L-精氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物必需氨基酸和生糖氨基酸，D-精氨酸在自然界中尚未发现。精氨酸中，与主链最接近的旁链部份是较长、有机及疏水的，而另一端的旁链则是一个胍基，这个胍基的酸度系数(PKa值)为12.48，在中性、酸性或碱性的环境下都是带正电荷的。因为在其双键及氮孤立电子对之间的共轭体系，使得其正电极离开原位，这个胍基能形成多重的氢键。
[0004]精氨酸的分子结构、电荷分布及形成多重氢键的能力，使得它能与带有负电荷的分子结合。因此，精氨酸在蛋白质的外围，能在带电荷的环境下产生相互作用。精氨酸是一氧化氮、尿素、鸟氨酸及肌丁胺的直接前体，是合成肌肉素的重要原素，且被用作聚胺、瓜氨酸及谷氨酰胺的合成。作为一氧化氮的前体，精氨酸可以协助舒张血管。非对称性二甲基精氨酸(ADMA)会压抑一氧化氮的化学作用，所以ADMA被认为是血管疾病的标记，就像精氨酸是健康内皮细胞层的象征一样。细胞培植研究指出当有机体外(试管内)赖氨酸与精氨酸的比例偏向赖氨酸时，可以压抑病毒的复制。在治疗上的成效却是未知的，但食用精氨酸会影响注射赖氨酸的效用。病人在进行手术(如胆囊切除术)以前，如先补充30g的精氨酸，会使病人维持正氮平衡而易于恢复.对肿瘤病人在进行大手术前鼻饲匀膳时，补充25g的精氨酸比补充同样氮含量的甘氨酸有效得多，更易于保持氮的正平衡.要使精氨酸发挥上述功效，其剂量较大甚至要达到每千克体重0.5g。
[0005]氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽，例如甘精胰岛素前体和猪蛔虫抗菌肽cecropin P1，序列中含有连续的两个精氨酸。甘精胰岛素，化学名称为21A —Gly-30Ba-L-Arg-30Bb-L-Arg-人胰岛素，分子式为 C267H4tl4N72O78S6,分子量为 6063。甘精胰岛素是一种在中性PH液中溶解度低的人胰岛素类似物。在胰岛素与其受体结合的动力学方面，甘精胰岛素同人胰岛素极为相似。因此可以认为它与经由胰岛素受体而介导胰岛素的作用相同，其主要作用是调节糖代谢。通过促进骨骼肌和脂肪等周围末梢组织摄取葡萄糖、抑制肝葡萄糖的产生而降低血糖的。临床药理学的研究表明，静脉注射等剂量的甘精胰岛素和人胰岛素，其效价是相同的。像所有的胰岛素一样，甘精胰岛素的作用时程可能受体力活动及其他因素的影响。对健康人及I型糖尿病患者的正常血糖钳夹研究表明，皮下注射甘精胰岛素的起效时间比低精蛋白锌人胰岛素(NPH)胰岛素慢，但甘精胰岛素的作用特性为平稳、无峰值、作用时间长。甘精胰岛素前体经过酶切纯化后即可获得甘精胰岛素。而甘精胰岛素前体的表达，与胰岛素的表达方法相似，可以参照专利US5656722、US4916212、CN1614019和CN1854299等。实验发现，甘精胰岛素前体与胰岛素前体相比，表达量较低。
[0006]猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl是一种具有广谱抗菌作用的抗菌肽,能够有效抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的生长。重组猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl有希望在饲料中的获得应用。
[0007]通常，通用的发酵培养基或培养液中均含有细胞生长以及表达外源蛋白所需的碳源、氮源、无机盐以及微量元素等成分，但并不一定含有小分子氨基酸。但细胞在大量表达外源蛋白时，如猪蛔虫抗菌肽cecropin P1、甘精胰岛素前体,其对某种特定氨基酸的需求大幅增加，若不能通过现有营养满足，那么这种氨基酸将可能成为限制蛋白产量的重要因素。例如当生物合成多肽中出现两个连续的精氨酸时，可能受到供应的限制，从而在一定程度上制约了多肽生物合成的速度，此多肽的常规表达量较低。因此，在培养基或培养液中直接加入精氨酸，作为重组多肽合成的前体物质，有利于提高多肽的合成速率，促进表达水平的提闻。
[0008]目前，重组大肠杆菌中新型溶栓酶(NTA)的发酵与表达优化在采用大肠杆菌表达NTA时，通过添加锌离子和乳糖提高外源蛋白的表达水平；申请号为200710027210.X、发明名称为“分泌表达蛋白酶的酵母菌培养方法”的中国专利公开了在发酵过程中流加补料甲醇能够提高蛋白酶的表达；申请号为201110239375.X、发明名称为“一种酿酒酵母高密度发酵培养基和酿酒酵母高密度发酵方法”的中国专利公开了在发酵过程中补加蔗糖；申请号为201010166684.4、发明名称为“一种以重组甲醇酵母发酵制备巴曲酶的方法”的中国专利公开了在发酵过程中补加加盐培养基。上述技术均在发酵过程中补充碳源、氮源、无机盐、诱导物来提高蛋白的表达。但是，如何提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法却未见报导。
`[0009]因此，提供一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸这种特定序列结构的多肽的表达量的方法具有重要意义。
【发明内容】
[0010]有鉴于此，本发明提供精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。该方法通过向发酵培养基或培养液中添加精氨酸，为细胞表达蛋白提供前体物质，从而使重组蛋白产量得到提高。
[0011]为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案:
[0012]本发明提供了精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用。
[0013]多肽，通常由10~100氨基酸通过肽键连接起来形成的化合物称为多肽。它们的分子量低于lOOOODa。
[0014]氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽是指在氨基酸序列中含有连续两个或更多精氨酸的多肽，例如本发明中举例的甘精胰岛素前体、猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl等，其氨基酸序列中含有连续精氨酸-精氨酸的结构。
[0015]通用的发酵培养基或培养液中均含有细胞生长以及表达外源蛋白所需的碳源、氮源、无机盐以及微量元素等成分，但并不含有小分子氨基酸。细胞在大量表达外源蛋白时，如猪蛔虫抗菌肽cecropin P1、甘精胰岛素前体,其对某种特定氨基酸的需求大幅增加,若不能通过现有营养满足，那么这种氨基酸将可能成为限制蛋白产量的重要因素。
[0016]精氨酸侧链含有3个C，以及一个碱性基团胍基，由于结构相对复杂，生物体合成精氨酸的代谢过程涉及多个步骤，因而其在蛋白质合成过程中很可能成为限制因素。其由α -酮戊二酸在乙酰谷氨酸合成酶作用下合成N-乙酰谷氨酸，与ATP在乙酰谷氨酸激酶作用下形成N-乙酰-Y谷氨酰磷酸，其与NAD (P)H在乙酰谷氨酸脱氢酶作用下形成N-乙酰谷氨酸--半醛，然后在转氨酶作用下合成N-乙酰鸟氨酸，再由乙酰鸟氨酸脱乙酰基酶作用合成L-鸟氨酸，然后跟氨基甲酰磷酸一起在鸟氨酸氨甲酰转移酶作用下合成瓜氨酸；再在精氨基琥珀合成酶作用下合成精氨酰琥珀酸；最后在精氨基琥珀酸裂解酶作用下形成精氨酸。该过程须由多个基因共同调节。当生物合成多肽中出现两个连续的精氨酸时，可能受到供应的限制，从而在一定程度上制约了多肽生物合成的速度，此多肽的常规表达量较低。因此，在培养基或培养液中直接加入精氨酸，作为重组多肽合成的前体物质，可能有利于提高多肽的合成速率，促进表达水平的提高。作为优选，多肽的表达系统为原核表达系统和真核细胞表达系统。
[0017]在本发明的一些实施例中，多肽的表达系统为酵母表达系统和哺乳细胞表达系统。
[0018]在本发明的一些实施例中，多肽的表达系统为酵母表达系统。
[0019]优选地，酵母表达系统中宿主细胞选自毕赤酵母属。
[0020]优选地，酵母表达系统中宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、 多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母。
[0021]更优选地，酵母表达系统中宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
[0022]更优选地，巴斯德毕赤酵母的菌株为GSl 15或Χ33。
[0023]作为优选，多肽为甘精胰岛素前体或猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl0
[0024]优选地，多肽为甘精胰岛素前体。
[0025]本发明还提供了一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法，包括如下步骤:
[0026]取菌株经第一接种到种子培养基中，经第一培养获得种子液；
[0027]取种子液经第二接种到发酵培养基中，经第二培养获得培养液，经诱导表达蛋白，即得；
[0028]发酵培养基中添加精氨酸。
[0029]作为优选，本发明提供一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法中，多肽的表达系统为原核表达系统、酵母表达系统或动物细胞表达系统。
[0030]在本发明的一些实施例中，多肽的表达系统为酵母表达系统。
[0031 ] 优选地，酵母表达系统中宿主细胞选自毕赤酵母属。
[0032]优选地，酵母表达系统中宿主细胞选自巴斯德毕赤酵母、甲醇毕赤酵母、酿酒酵母、栗酒裂殖酵母、解脂耶氏酵母、多形汉森酵母、乳酸克鲁维酵母。
[0033]更优选地，酵母表达系统中宿主细胞为巴斯德毕赤酵母。
[0034]更优选地，巴斯德毕赤酵母的菌株为GSl 15或X33。
[0035]作为优选，多肽为甘精胰岛素前体或猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl0
[0036]优选地，多肽为甘精胰岛素前体。
[0037]甘精胰岛素前体蛋白一般由人胰岛素B链(末端增加两个精氨酸)+连接肽(即C肽，甘精胰岛素前体蛋白可以无C肽)+人胰岛素A链(A21位置为甘氨酸)组成，其中所述A链和B链氨基酸序列固定，而C肽序列可存在多种，这些为本领域技术人员公知。本发明选取本领域5种不同C肽序列作为连接肽以及不采用连接肽(即B链末端精氨酸和A链起始的甘氨酸直接通过酰胺键相连)，用以验证所述提高表达量的方法能够适用于不同C肽序列的甘精胰岛素前体蛋白发酵液。
[0038]作为优选，所述甘精胰岛素前体蛋白的C肽序列为SEQ ID N0:1所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列、SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
[0039]本发明的培养基配方均采用质量体积比，如精氨酸0.87%为100ml培养基中含精氨酸为0.87g，如酵母粉1%为100ml培养基中含酵母粉Ig等。
[0040]在本发明的一些 实施例中，以g/mL计，精氨酸与发酵培养基的质量体积比为0.087 ~1.74:100。
[0041]在本发明的另一些实施例中，以g/mL计，精氨酸与发酵培养基的质量体积比为0.17 ~1.39:100。
[0042]在本发明的另一些实施例中，以g/mL计，精氨酸与发酵培养基的质量体积比为0.61 ~1.13:100。
[0043]作为优选，种子液占发酵培养基的体积百分数为2~15%。
[0044]本发明还提供了一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:
[0045]取含有甘精胰岛素前体序列的毕赤酵母菌株接种到种子培养基中，振荡培养获得种子液；
[0046]取所述种子液接种到添加了精氨酸的发酵培养基中，振荡培养，加入无水甲醇诱导表达蛋白，即得。
[0047]具体的，本发明还提供了一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:
[0048]取含有甘精胰岛素前体序列的毕赤酵母菌株接种到BMGY种子培养基中，振荡培养获得种子液，种子液的OD6tltl为2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0049]取种子液接种到添加了精氨酸的BMMY发酵培养基中，振荡培养，加入无水甲醇诱导表达蛋白，即得。
[0050]其中，种子培养基的配方为酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，生物素4X 10_5%，甘油1%。
[0051]发酵培养基的配方为:酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，甘油1%，精氨酸0.87%，0.1M pH6.0磷酸钾溶液。
[0052]作为优选，本发明提供的一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:
[0053]取含有甘精胰岛素前体序列的毕赤酵母菌株接种到BMGY种子培养基中，于30°C、220r/min振荡培养获得种子液，种子液的OD6tltl为2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0054]取种子液接种到添加了精氨酸的BMMY发酵培养基中，于30°C、220r/min振荡培养14~24h后，按每12h加入无水甲醇开始诱导表达蛋白，诱导96h后，即得。
[0055]本发明还提供了一种提高猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl表达量的方法,包括如下步骤:
[0056]取含有猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl序列毕赤酵母接种到种子培养基中,振荡培养获得第一种子液；
[0057]取所述第一种子液接种到发酵培养基中，振荡培养获得第二种子液；
[0058]取所述第二种子液加入精氨酸获得培养液，振荡培养，即得；
[0059]以g/mL计，所述精氨酸与所述培养液的质量体积比为0.5%。
[0060]具体的，本发明还提供了一种提高猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl表达量的方法，包括如下步骤:
[0061]取含有猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl序列的毕赤酵母菌株接种到BMGY种子培养基中，振荡培养获得种子液，种子液的OD6tltl为2~22，2~6，6~12，12~17或17~22。
[0062]取种子液接种到添加了精氨酸的BMMY发酵培养基中，振荡培养，加入无水甲醇诱导表达蛋白，即得。
`[0063]其中，种子培养基的配方为酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，生物素4X 10_5%，甘油1%。
[0064]发酵培养基的配方为:酵母粉1%，蛋白胨2%，YNB1.34%，甘油1%，精氨酸0.87%，0.1M pH6.0磷酸钾溶液。
[0065]作为优选，本发明提供的一种提高猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl表达量的方法，包括如下步骤:
[0066]取含有猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl序列的毕赤酵母菌株接种到BMGY种子培养基中，于30°C、220r/min振荡培养获得种子液，种子液的OD600为2~22，2~6，6~12，12~17 或 17 ~22。
[0067]取种子液接种到添加了精氨酸的BMMY发酵培养基中，于30°C、220r/min振荡培养14~24h后，按每12h加入无水甲醇开始诱导表达蛋白，诱导96h后，即得。
[0068]以g/mL计，精氨酸与培养液的质量体积比为0.5%。
[0069]本发明还提供了一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:
[0070]取含有甘精胰岛素前体质粒的动物细胞，复苏、稀释后接种于培养液中获得细胞液；
[0071]取所述细胞液振荡培养，获得第一培养液；
[0072]取所述第一培养液接种于添加精氨酸的培养液中传代培养，即得。
[0073]具体的，本发明还提供了一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:
[0074]取含有甘精胰岛素前体质粒的CHO DG44克隆细胞，复苏、稀释后接种于CDOptiCHO培养液中获得细胞液，细胞液的细胞密度为4X IO5活细胞/mL ；
[0075]取细胞液振荡培养，获得第一培养液，第一培养液中活细胞密度为1.0~1.5 X IO6活细胞/mL ；
[0076]取第一培养液接种于添加精氨酸的CD OptiCHO培养液中传代培养,即得。
[0077]作为优选，本发明提供的一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，包括如下步骤:[0078]取含有甘精胰岛素前体质粒的CHO DG44克隆细胞，复苏、稀释后接种于CDOptiCHO培养液中获得细胞液，细胞液的细胞密度为4X IO5活细胞/mL ；
[0079]取细胞液于37°C、8%C02、130r/min振荡培养，获得第一培养液，第一培养液中活细胞密度为1.0~1.5 X IO6活细胞/mL ；
[0080]取第一培养液经300 Xg离心5min后接种于添加精氨酸的⑶OptiCHO培养液中传代培养10d，即得。
[0081]基于上述本发明提供的一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，本领域技术人员也可以通过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加，提供一种提高也含有连续精氨酸的甘精胰岛素前体类似物多肽表达量的方法。
[0082]本发明提供精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法。该方法通过向发酵培养基或培养液中添加精氨酸，为细胞表达蛋白提供前体物质，从而使重组蛋白产量得到提高。本发明提出在发酵培养基或培养液中加入定量的精氨酸，从而显著提高重组细胞表达外源蛋白的广量，可提闻36%及以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0083]图1示实施例1中对照组获得的发酵上清液甘精胰岛素前体的HPLC谱图；
[0084]图2示实施例1中试验组获得的发酵上清液甘精胰岛素前体的HPLC谱图；
[0085]图3示实施例1中甘精胰岛素前体标准品的HPLC谱图。
【具体实施方式】
[0086]本发明公开了精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0087]本发明提供的精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用及提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法中所用菌株、细胞、氨基酸、制剂均可由市场购得。其中，精氨酸由深圳尚能生物科技有限公司提供。
[0088]本发明有关毕赤酵母GS115的重组菌株参考“Mult1-copy Pichia ExpressionKit”操作获得；有关毕赤酵母X33的重组菌株参考“EasySelect Pichia Expression Kit”操作获得；有关大肠杆菌BL21的重组菌株参考“原核蛋白表达宝典一大肠杆菌表达系统操作手册，Novagen”操作获得；有关CHO DG44克隆细胞参考“Freedom DG44Kit”操作获得。
[0089]下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0090]实施例1
[0091]本实验组甘精胰岛素前体不含C肽序列。
[0092]试验组:
[0093]将甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因(无C肽)的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0094]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.87%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0095]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0096]诱导96h后结束发酵。
[0097]对照组:
[0098]将甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因(无C肽)的重组毕赤酵母GS115菌株接种于装有BMGY种子培养基的250ml培养瓶中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0099]将培养得到的种子液5ml接种于装有BMMY发酵培养基的500ml培养瓶中，装瓶量50ml ο 30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0100]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0101]诱导96h后结束发酵。
[0102]结果检测:
[0103]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.070g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0520g/L，提高34.62%。
[0104]实施例2
[0105]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID N0:2所示氨基酸序列。
[0106]试验组:
[0107]取经复苏的含有甘精胰岛素前体的CHO DG44克隆细胞，稀释细胞，接种于完全125ml的细胞培养摇瓶中，⑶OptiCHO培养液装量40ml，使最终细胞密度为4X IO5活细胞/ml。
[0108]细胞于125ml细胞培养摇瓶(装瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培养，当活细胞密度达到1-1.5XCD OptiCHO培养液106cells/ml时，传代细胞。
[0109]300Xg离心 5分钟，更换新鲜的含0.3%精氨酸的完全⑶OptiCHO培养液，细胞密度为3X105cells/ml，连续培养10天，停止培养。
[0110]对照组:
[0111]取经复苏的含有甘精胰岛素前体的CHO DG44克隆细胞，稀释细胞，接种于完全125ml的细胞培养摇瓶中，⑶OptiCHO培养液装量40ml，使最终细胞密度为4X IO5活细胞/ml。[0112]细胞于125ml细胞培养摇瓶(装瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培养，当活细胞密度达到1-1.5XCD OptiCHO培养液106cells/ml时，传代细胞。
[0113]300Xg离心5分钟，更换新鲜的完全⑶OptiCHO培养液细胞密度为3 X IO5Cells/ml，连续培养10天，停止培养。
[0114]结果检测:培养结束，分别取试验组和对照组的培养液经12000rpm离心IOmin,HPLC检测上清液甘精胰岛素前体含量为20.25mg/L,不加精氨酸的对照上清液甘精胰岛素前体含量为16.47mg/L，提高了 22.95%。
[0115]实施例3
[0116]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID N0:3所示氨基酸序列。
[0117]试验组:
[0118]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组大肠杆菌BL21菌株，接种100 μ I于25ml摇瓶的LB培养基中，装瓶量5ml。37°C，220rpm振荡培养过夜，0D600约0.5。
[0119]将培养得到的培养液取1.5ml接种于250ml摇瓶的含有100 μ g/ml的LB培养基中，装瓶量 50ml。37。。，220rpm 振荡培养 2h，OD600 约 0.9。
[0120]加入240mg/ml的IPTG50ul，使终浓度为1禮，再加入精氨酸至终浓度0.5% (质量体积比)。370C，250rpm振荡培养4h，结束培养。
[0121]对照组:
[0122]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组大肠杆菌BL21菌株，接种100 μ I于25ml摇瓶的LB培养基中，装瓶量5ml。37。。，220rpm振荡培养过夜，OD600约0.5。
[0123]将培养得到的培养液取1.5ml接种于250ml摇瓶的含有100 μ g/ml的LB培养基中，装瓶量 50ml。37。。，220rpm 振荡培养 2h，OD600 约 0.9。
[0124]加入240mg/ml的IPTG50ul，使终浓度为ImM。37°C，250rpm振荡培养4h，结束培养。
[0125]结果检测:
[0126]分别取对照组的培养液和试验组培养液各三组50ml，以4000rpm离心15min以获得大肠杆菌细胞沉淀。
[0127]收集菌体，分别加入Iml去离子水，采用超声破碎方法，超声4s (120W),间隔4s，99次，两个循环。破碎结束后，离心，将细胞壁等杂质除去，得到包涵体。包涵体用蒸馏水按照I:15比例,洗漆30min,8000rpm离心5min,去上清液。
[0128]将初步纯化好的包涵体按照1:60比例加入磺酸化试剂(7M尿素、pH9.0Tris-HCl 15mM, EDTAlmM、Na2SO30.4M、CuSO4.5H205mM、甘氨酸 ImM)，室温，轻轻搅拌10h，离心弃沉淀，上清用去离子水稀释至尿素终浓度2M，置于磁力搅拌器上缓慢搅拌的同时，加入0.5M盐酸调整溶液pH至等电点左右，沉淀，离心，收集沉淀。沉淀用去离子水冲洗2 次，然后复溶于 8M 尿素(pH9.0Tris-HCl 15mM, EDTAIM)0
[0129]用HPLC检测，补加精氨酸上清液甘精胰岛素前体的三组含量平均为0.587g/L，未加精氨酸的对照上清液甘精胰岛素前体的三组含量平均为0.429g/L，提高了 36.8%。
[0130]实施例4
[0131]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0132]试验组:[0133]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0134]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.17%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0135]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0136]诱导96h后结束发酵。
[0137]对照组:
[0138]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0139]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0140]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0141]诱导96h后结束发酵。
[0142]结果检测:
[0143]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0549g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0513g/L，提高7.02%。
[0144]实施例5`
[0145]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0146]试验组:
[0147]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0148]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.61%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0149]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0150]诱导96h后结束发酵。
[0151]对照组:
[0152]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0153]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0154]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0155]诱导96h后结束发酵。
[0156]结果检测:
[0157]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0647g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0505g/L，提高28.12%。[0158]实施例6
[0159]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0160]试验组:
[0161]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0162]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.087%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0163]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。 [0164]诱导96h后结束发酵。
[0165]对照组:
[0166]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0167]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0168]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0169]诱导96h后结束发酵。
[0170]结果检测:
[0171]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0533g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0498g/L，提高7.03%。
[0172]实施例7
[0173]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
[0174]试验组:
[0175]取经复苏的含有甘精胰岛素前体的CHO DG44克隆细胞，稀释细胞，接种于完全125ml的细胞培养摇瓶中，⑶OptiCHO培养液装量40ml，使最终细胞密度为4 X IO5活细胞/ml。
[0176]细胞于125ml细胞培养摇瓶(装瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培养，当活细胞密度达到1-1.5XCD OptiCHO培养液106cells/ml时，传代细胞。
[0177]300Xg离心5分钟，更换新鲜的完全⑶OptiCHO培养液(含精氨酸1.0%，)，细胞密度为3X 105，连续培养10天，停止培养。
[0178]对照组:
[0179]取经复苏的含有甘精胰岛素前体的CHO DG44克隆细胞，稀释细胞，接种于完全125ml的细胞培养摇瓶中，⑶OptiCHO培养液装量40ml，使最终细胞密度为4X IO5活细胞/ml。
[0180]细胞于125ml细胞培养摇瓶(装瓶量1/3)中37°C、8%C02，130rpm培养，当活细胞密度达到1-1.5XCD OptiCHO培养液106cells/ml时，传代细胞。
[0181]300Xg离心5分钟，更换新鲜的完全⑶OptiCHO培养液(不含精氨酸)，细胞密度为3X 105，连续培养10天，停止培养。[0182]结果检测:培养结束，分别取试验组和对照组的培养液经12000rpm离心lOmin，HPLC检测上清液甘精胰岛素前体含量为21.76mg/L,不加精氨酸的对照上清液甘精胰岛素前体含量为16.28mg/L，提高了 33.66%。
[0183] 实施例8
[0184]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID N0:4所示氨基酸序列。
[0185]试验组:
[0186]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母x33菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0187]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.5%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0188]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0189]诱导96h后结束发酵。
[0190]对照组:
[0191]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母x33菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0192]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0193]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0194]诱导96h后结束发酵。
[0195]结果检测:
[0196]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0601g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0509g/L，提高18.07%。
[0197]实施例9
[0198]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0199]试验组:
[0200]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0201]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有1.13%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0202]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0203]诱导96h后结束发酵。
[0204]对照组:
[0205]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0206]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。[0207]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一
次，至发酵培养结束。
[0208]诱导96h后结束发酵。结果检测:
[0209]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0651g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0499g/L，提高30.46%。
[0210]实施例10 [0211]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID N0:1所示氨基酸序列。
[0212]试验组:
[0213]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0214]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有1.39%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0215]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0216]诱导96h后结束发酵。
[0217]对照组:
[0218]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0219]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0220]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0221]诱导96h后结束发酵。
[0222]结果检测:
[0223]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0578g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0517g/L，提高12%。
[0224]实施例11
[0225]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0226]试验组:
[0227]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0228]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有1.74%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0229]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0230]诱导96h后结束发酵。
[0231]对照组:
[0232]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。[0233]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0234]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0235]诱导96h后结束发酵。
[0236]结果检测:
[0237]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.0559g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0511g/L,提高9.39%。
[0238]实施例12
[0239]本实验组甘精胰岛素C肽序列:SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
[0240]试验组:
[0241]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0242]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有1.0%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30° C，220r/min振荡培养12h。
[0243]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0244]诱导96h后结束发酵。
[0245]对照组:
[0246]取甘油管保存的含有甘精胰岛素前体基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0247]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0248]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0249]诱导96h后结束发酵。
[0250]结果检测:
[0251]HPLC检测发酵上清液甘精胰岛素前体含量0.071g/L,不加精氨酸对照发酵瓶甘精胰岛素前体含量0.0522g/L,提高36.01%。
[0252]实施例13
[0253]试验组:
[0254]取甘油管保存的含有cecropin Pl基因的重组毕赤酵母GS115菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0255]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的含有0.5%精氨酸的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min振荡培养12h。
[0256]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0257]诱导96h后结束发酵。
[0258]对照组:参照文献中所记载方法。详见(李巍，仲飞，李秀锦等.重组猪蛔虫抗菌肽.[J].中国兽医学报，2011,31 (8):1133-1137.)。
[0259]取甘油管保存的含有cecropin Pl基因的重组毕赤酵母GSl 15菌株接种于250ml摇瓶的BMGY种子培养基中，装瓶量25ml，30°C，220r/min振荡培养至20h，结束培养。
[0260]将培养得到的种子液5ml接种于500ml摇瓶的BMMY发酵培养基中，装瓶量50ml，30°C，220r/min 振荡培养 12h。
[0261]30°C，220r/min振荡培养，加入500 μ I无水甲醇诱导表达蛋白，每12小时添加一次，至发酵培养结束。
[0262]诱导96h后结束发酵。
[0263]结果检测:
[0264]HPLC检测发酵上清液猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl含量0.142g/L，不加精氨酸对照发酵瓶猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl含量0.117g/L，提高17.61%。
[0265]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.精氨酸在提高发酵培养氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为原核表达系统和真核表达系统。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为酵母表达系统或哺乳动物细胞表达系统。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述多肽的表达系统为酵母表达系统。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述酵母表达系统中宿主细胞选自毕赤酵母属。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述毕赤酵母的菌株为GS115或X33。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽为甘精胰岛素前体或猪蛔虫抗菌月太 cecropin Pl0
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述多肽为甘精胰岛素前体。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘精胰岛素前体的C肽序列为SEQIDNO:1所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列、SEQ ID NO: 3所示氨基酸序列、SEQID NO:4所示氨基酸序列或SEQ ID N0:5所示氨基酸序列。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述甘精胰岛素前体无C肽。
11.一种提高氨基酸序列含有精氨酸-精氨酸的多肽的表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤:· 取基因工程构建菌株经第一接种到种子培养基中，经第一培养获得种子液； 取所述种子液经第二接种到发酵培养基中，经第二培养获得培养液，经诱导表达蛋白，即得； 所述发酵培养基中添加精氨酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述精氨酸与所述发酵培养基的质量体积比为0.087~1.74:100。
13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述精氨酸与所述发酵培养基的质量体积比为0.17~1.39:100。
14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，以g/mL计，所述精氨酸与所述发酵培养基的质量体积比为0.61~1.13:100。
15.一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤: 取基因工程构建甘精胰岛素前体序列的毕赤酵母菌株接种到种子培养基中，振荡培养获得种子液； 取所述种子液接种到添加了精氨酸的发酵培养基中，振荡培养，诱导表达蛋白，即得。
16.—种提高猪蛔虫抗菌肽cecropin Pl表达量的方法,其特征在于,包括如下步骤: 取基因工程构建cecropin Pl的大肠杆菌接种到种子培养基中，振荡培养获得第一种子液； 取所述第一种子液接种到发酵培养基中，振荡培养获得第二种子液； 取所述第二种子液加入精氨酸获得培养液，振荡培养，即得； 以g/mL计，所述精氨酸与所述培养液的质量体积比为0.5%。
17.一种提高甘精胰岛素前体表达量的方法，其特征在于，包括如下步骤:取基因工程构建甘精胰岛素前体序列的动物细胞，复苏、稀释后接种于培养液中获得细胞液； 取所述细胞液振荡培养，获得第一培养液； 取所述第一培养液接 种于添加精氨酸的培养液中传代培养，即得。
【文档编号】C12R1/84GK103589767SQ201310361852
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年8月19日 优先权日:2012年8月17日
【发明者】陈小锋, 李利佳, 李晓平, 郑翔芳, 张均, 李文佳 申请人:宜昌长江药业有限公司