通过单点突变缺失结构中的盐键提高pae酶活的方法
【专利摘要】本发明提供一种通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法。利用定点突变技术，通过缺失催化腔附近的单个盐键，将形成盐键3的Asp201-Arg205中的Asp201定点突变为Ala，构建突变体D201A，提高了PAE的活力。本发明不但对揭示M4家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义，同时，由于很多M4家族蛋白酶是重要的医学、工业用酶，因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。
【专利说明】通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程方法提高酶活力【技术领域】，特别是涉及通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法。
【背景技术】
[0002]蛋白酶(peptidase, proteases, proteinases 或 proteolytic enzymes)是一类可催化蛋白质或肽类肽键水解的酶类。
[0003]弹性蛋白(e last in )在动物组织中广泛存在，如富有弹性的组织、肺、大动脉、某些韧带、皮肤及耳部软骨等。弹性蛋白由多条弹性蛋白原(tropoelastin)多肽链以共价交联方式连接而成(Yeo et al.，2011)，具 有非常稳定的结构，而且不含常见蛋白酶识别的氨基酸和酶切位点，使得弾性蛋白只能被弾性蛋白酶分解。能够水解弾性蛋白的蛋白酶称为弹性蛋白酶(elastase )。
[0004]按照来源分，弾性蛋白酶可分为微生物弾性蛋白酶和动物弾性蛋白酶。其中，哺乳动物弹性蛋白酶主要存在于动物的胰腺和吞卩遼细胞中(Horwitz et al.，1999; Masonet al., 1986; Bode et al., 1989; Antonicelli et al., 2007)。研究比较多的细菌来源的弹性蛋白酶有金属蛋白酶M4家族的PAE/pseudolysin (Morihara and Homma, 1985)和 vibriolysin (Lutfullah et al., 2008)、M9 家族的 MAPI peptidase (Dumont et al.,1994)、M12 家族的 myroilysin (Chen et al., 2009a)、M23 家族的 staphylolysin(Kesslerand Ohman, 2004b)和丝氨酸蛋白酶 S8 家族的 Alpl (Behnsen et al., 2010)等。
[0005]弾性蛋白酶在医学、食品学和日用化学上有着广泛应用。在医药方面主要作为治疗药物:(1)治疗高脂血症，(2)防治动脉粥样硬化，(3)抑制脂肪肝发展，(4)治疗慢性气管炎及其它结缔组织纤维增生性疾病，(5)外用于消除皮肤焦痂、碎屑，用于烧伤患者的治疗以及皮肤溃疡、口腔溃疡等症。在食品エ业方面常用于对动物难以处理和食用的韧带、大动脉血管、筋腱等蛋白质废料进行加工。日用化学エ业方面，弾性蛋白酶主要用于疗效化妆品的生产。
[0006]PAE (Pseudomonas aeruginosa Elastase, pseudolysin)是革兰氏阴性机会致病菌铜绿假单孢菌(Pseudomonas aeruginosa, PA)分泌的一种胞外弹性蛋白酶，可以降解酪蛋白、血红蛋白、卵清蛋白、纤维蛋白等。在底物特异性方面，PAE倾向降解Ρ-位为疏水或芳香族氨基酸的肽键(Morihara 1995; Morihara et al., 1965)。目前，已经商品化的PA来源的PAE售价昂贵，EPC公司(Elastin Products Company Inc.)姆0.1 mg PAE 售价 183 美兀(PE961, https://www.elastin.com/storefront/tabid/58/c/Metalloproteinases/CategoryID/19/Default, aspx), Merck 公司姆 0.lmg PAE 售价 4δ00兀人民币(324676-100UG, http://www.millipore.com/catalogue/item/324676-100ug)。PAE能够在原核细胞和真核细胞中异源表达并且重组酶有酶活(0gino，H.et al.，2000;Lin et al., 2009)。我们前期研究表明将构建好的含hi基因的表达载体转化至万.BL21 (DE3)中，1 L培养物细胞经超声破碎和柱层析纯化后，可获得纯酶4.5 mg,总酶活285984个酶活単位(酶活力定义为60 --C，每分钟催化酪蛋白水解生成1 yg酪氨酸的酶量为 1 个单位 U) (Xie et al., 2009)。
[0007]作为PA分泌的主要胞外内切蛋白酶以及它本身的降解宿主蛋白的能力，PAE可以用作模式蛋白来生产特殊的蛋白酶抑制剂，用于疾病治疗(Jan Potempa and Robert N.Pike, 2009 ；Maciej Sataga et al.，2013)。PAE具有在有机溶剂中仍能保持高活性和热稳定性的特性使得其在エ业催化方面具有巨大的应用潜力。Ogino通过构建Cys30-Cys58、Cys270-Cys297 ニ硫键缺失的PAE突变体证实了 Cys30_Cys58 ニ硫键对维持PAE在有机溶剂中的热稳定性有重要意义(Ogino H.et al.，2001), Lousa, D.利用分子动力学模拟验证了上述结论(Lousa，D.et al.，2012)。将PAE的114位Tyr突变为Phe使得突变体在有机溶剂环境中催化合成阿巴斯甜前体时具有与thermolysin相同的活力，而将Tyr突变为Ser和Arg后这种活力提高得更明显(Ogino et al.，2010)。利用定点突变技术研究PAE的活性和稳定性的研究主要集中在上述文献中。
[0008]Thermolysin与PAE同为金属蛋白酶M4家族的蛋白酶，两者不仅序列相似性很高，而且具有几乎完全一致的三维结构(Holmes and Matthews, 1982; Thayer et al., 1991):N端结构域主要由反向片层构成，C端结构域由α -螺旋组成，两个结构域之间有ー个催化腔，结合Ζη的残基与结合底物的残基都位于催化腔内壁上(图1)。利用定点突变技术对thermolysin的活性和热稳定性 进行研究的例子非常多。例如，thermolysin N端结构域G8C/N60C/S65C三个位点的同时突变使得突变体中结合Ca的残基与Ca的亲和カ增强而导致突变体的热稳定性增强(Kawasaki Y.et al., 2013; Yasukawa K.and Inouye K.,2007)。Thermolysin N端结构域中连接2个反向β -片层的Asnll6_Glyll7转角中的Asn残基对稳定thermolysin的β发卡结构至关重要,Asn突变为Asp后导致thermolysin突变体活性提高同时热稳定性降低(Menach E.et al.，2012)。在前期研究单点突变(L144S，D150E, I168A)提高 thermolysin 的活性和单点突变(S53D, L155A)提高 thermolysin 稳定性的基础上，Kusano Μ (2010)研究了双突和三突产生的突变体的活性和稳定性的变化，发现L144S/D150E突变体活性最高，S53D/L155A突变体热稳定性最好，L144S/D150E/ S53D突变体的活性和热稳定性都提高了，这些多突变体的效果是单突的叠加(Kusano M.et al.，2010)。通过对thermolysin活性中心附近的几个结构域,包括N端β片层、2个α -螺旋和C端2个loop上氨基酸残基的单点突变，Kusano Μ.等掲示了 Ν端β片层和2个α-螺旋对thermolysin的催化至关重要,而C端2个loop负责了酶对底物的识别(Kusano M.etal., 2009)。通过将thermolysin中的Ser残基突变为Asp来向thermolysin引入负电荷，研究发现在高盐条件下大多数突变体的催化效率kcat/km提高了，在10 mM CaCl2条件下两个突变体S53D和S6?的热稳定性也有所提高(Takita T.et al.，2008)。将thermolysin的一个自溶位点Glyl54-Leul55中的Leul55分别突变为Ala/Ser/Phe/Gly后，各突变体的热稳定性都有所提高，但同时产生了新的自溶位点(Matsumiya Y.et al., 2004)。
[0009]前期生化实验、分子动力学模拟和计算分析表明，盐键的差异很可能是PAE与同源酶之间热稳定性差异的主要原因(Xie et al., 2009)。但结合文献发现，目前对PAE的活性和热稳定性的研究很少，对M4家族中研究更深入的模式蛋白酶thermolysin的活性和热稳定性的研究也并未把盐键的作用深入分析。
【发明内容】
[0010]针对上述PAE的研究现状，本发明提供了通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法。利用定点突变技术，通过缺失催化腔附近的单个盐键，本发明提高了 PAE的活力，对形成盐键3(Asp201 — Arg205)的Asp201定点突变为Ala，构建突变体D201A，在E.coli中异源表达并测得D201A仍具有蛋白酶活力。将D201A利用DEAE-S印harose FastFlow离子交换层析分离纯化，获得了电泳纯的重组酶。Folin-酚法测定D201A和PAE水解酪蛋白的酶活，在45-75--C实验温度条件下，D201A的比活力均比PAE高7.1-32.3%不等；在最适酶活温度65--C时D201A的比活力比PAE提高了 14%。本发明不但对掲示M4家族金属蛋白酶的结构和功能关系具有重要意义，同吋，由于很多M4家族蛋白酶是重要的医学、エ业用酶，因此本发明对该家族蛋白酶的分子改造研究和相关新产品的开发也具有重要指导意义。
[0011]本发明的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法技术方案为，通过缺失催化腔附近的单个盐键，提高PAE的比活力。
[0012]如说明书附图图1所示，PAE中含有6个盐键(残基正负电荷间距离小于4 --，不考虑His形成的盐键)。将PAE与同源蛋白进行序列比对分析表明，盐键1、2和6是保守存在的，说明这些盐键对维持PAE的活性起重要作用。PAE中的6个盐键分属两个区域，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端。催化腔附近的3个盐键都位于稳定性很差的loop区或相邻区域。
[0013]形成盐键1-3的氨基酸在PAE—维序列中的位置(盐键1:D168_R198 ;盐键2:R179-D189 ;盐键 3:D201-R205)如下:
【权利要求】
1.一种通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，PAE中残基正负电荷间距离小于4 --，不考虑His形成的盐键之外含有6个盐键，盐键1-3位于催化腔附近，盐键4-6位于C端结构域的C末端，将形成盐键3的Asp201-Arg205中的Asp201进行定点突变，提高PAE比活力。
2.根据权利要求1所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，将形成盐键3的Asp201-Arg205中的Asp201定点突变为Ala，构建突变体D201A。
3.根据权利要求2所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，突变体D201A的引物: 两端引物: 正向引物:GCTTGGACCATATGAAGAAGGTTTCTACGCTTGACC，划横线部分表示Nde I酶切位点； 反向引物:CGCGCTCGAGTTACAACGCGCTCGGGCAG,划檑线部分表示Xho I酶切位点； D201A中间引物: 3 ’ 端引物:GCGCTGCGCTACATGGCGCAGCCCAGCCGCGAC
5 ’ 端引物:GCGGCTGGGCTGCGCCATGTAGCGCAGCGCACCG。
4.根据权利要求3所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，突变体的原核表达为: ①以含NdeI酶切位点的正向引物和突变体中间引物的3’引物为两端引物，以ム质粒为模板，扩增产物标为I ;以含Xho I酶切位点的反向引物和突变体中间引物的5’引物为两端引物，以leisB质粒为模板，扩增产物标为II ； ②回收I和II，通过PCR反应程序，将I基因和II基因相互融合； ③最后再加入两侧正、反向引物通过PCR反应程序，得到突变体基因。
5.根据权利要求4所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，有酶活突变体的筛选: ①利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，EB染色，切取目的片段大小的DNA，回收DNA; ②DNA用限制性内切酶NdeI和Xho I酶切，连接同样酶切过的pET_22b表达载体； ③连接产物转化万.coliDH5a ； ④从转化平板上挑取转化子至液体LB培养基中培养，利用提质粒酶切验证的方法筛选携带目的基因的转化子； ⑤将测序正确的含目的基因的质粒转化^:coli BL21 (DE3)； ⑥从平板上挑取转化子单菌落到试管中，37--C过夜培养后按1%接种量转接到三角瓶中，37--C培养至0D_ =1.0左右加入终浓度1 mM的IPTG继续培养过夜； ⑦发酵液离心收集菌体，菌体用三蒸水洗涤3遍以上后用50mM, pH 8.0的Tris_HCl缓冲液重悬，超声破碎至菌液澄清，超声完毕后离心，上清在30--C保温2 h ； ⑧用Folin—酚法测粗酶液酶活。
6.根据权利要求5所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，步骤⑦发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为:功率300 w，超声5 s，间隔10 s，超声10次。
7.根据权利要求6所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，重组酶分离纯化: ①按1%接种量扩大培养含各突变体质粒的E.coli BL21 (DE3)，当菌浓0D6(I(I=1.0吋，添加终浓度 1 mM IPTG，在 37--C，160-180 rpm 诱导 12 h ； ②发酵液离心收集菌体，用50mM, pH 8.0的Tris_HCl缓冲液重溶菌体，超声破碎；超声完毕后离心，上清在30--C保温2 h后用60%硫酸氨沉淀过夜； ③沉淀的蛋白用Tris-HCl缓冲液重溶、透析,进行DEAE-SepharoseFast Flow离子交换层析分离； ④测各收集管中样品的酶活，酶活高的组分进行SDS-PAGE分析，收集电泳纯的酶组分混合，装在透析袋里用pH 8.0，50 mM的Tris-HCl缓冲液透析后分装。
8.根据权利要求7所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，步骤②发酵液离心收集菌体，超声破碎条件为:功率300 w，超声5 s，间隔10 s，每100 ml菌体超声30次。
9.根据权利要求7所述的通过单点突变缺失结构中的盐键提高PAE酶活的方法，其特征在于，步骤③DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析柱层析分离前,先用50 mM, pH9.5的Tris-HCl缓冲液平衡；洗脱时仍采用相同的缓冲系统，梯度洗脱时NaCl浓度范围为 0-0.5 M。
【文档编号】C12N9/66GK103451173SQ201310368569
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】边斐, 毕玉平, 彭振英, 杨连群, 于金慧, 宣宁, 张燕 申请人:山东省农业科学院生物技术研究中心