miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用。具体地，本发明通过高通量microRNA芯片对肿瘤患者的肿瘤组织进行研究以及对人类miRNA文库进行大规模筛选，在大量microRNA中，发现miR-27b在肿瘤中普遍下调，且miR-27b家族成员能提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。本发明还发现miR-27b以肿瘤耐药信号通路上的p53和CYP1B1等基因为靶点；促进p53和抑制CYP1B1表达可提高肿瘤对抗肿瘤药的敏感性。
【专利说明】miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术和医学领域，具体地，本发明涉及抗肿瘤耐药相关的 microRNA及其应用。
【背景技术】
[0002] 使用抗肿瘤药物是肿瘤治疗的重要方案，尤其对于不能进行手术切除的晚期肿瘤 尤为重要。然而，临床研究表明，肿瘤细胞对药物的耐受是造成用药失败的主要原因，尤其 对于肝癌和肾癌这两类实体瘤，耐药现象尤为严重，sorafenib作为最有效的靶点特异性药 物之一，也仅能短暂地延长病人三个月的存活时间。而且肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐 药性以后，往往还会发展出对其他结构和功能不相关药物的耐受性。这种多药耐药性现象 提示我们，肿瘤细胞有可能采用某些普遍的分子机制来对抗不同类型的抗肿瘤药物，这些 分子机制包括：肿瘤细胞内药物积累减少，肿瘤细胞逃避药物所诱导的死亡，以及肿瘤细胞 对药物解毒能力的增强。理论上来说，抑制这其中任意一条关键的耐药性信号通路都应该 能增强肿瘤细胞对药物的响应，但事实上针对这些信号通路设计的药物在临床转化中却并 不尽如人意。这主要是因为多种耐药性信号通路之间相互联系，形成复杂的调控网络，当某 条通路被抑制后，其他的耐药性通路依然持续发挥着作用，单独考虑某一条信号通路来解 决肿瘤细胞耐药性的问题是不够的。另外，耐药性信号通路的冗余性和复杂性造成了不同 的病人对药物响应存在差异，对于不同类型的病人需要有所区分从而采用适合的分子标志 物来预测药物响应，因此单一地考虑某一条耐药性通路也为寻找合理的分子标志造成了局 限。综上所述，我们认为寻找一个能抑制多条耐药性信号通路的新靶点将更有效地增强肿 瘤细胞对药物的响应，并且对于多种耐药性分子机制综合性的理解也将有助于找到更为准 确合理的分子标志从而指导个性化治疗。
[0003] miRNA是重要的转录后调控因子，能够参与到众多的生物学过程当中，其中也包括 肿瘤发生。应用miRNA作为未来的一种肿瘤治疗手段具有很多优势，其中最为重要的是， miRNA能够同时抑制多条信号通路来实现其生物学功能。因此，肿瘤细胞复杂而冗余的耐 药性通路有望通过miRNA的应用来得以控制。那么是否存在调控肿瘤耐药性的关键miRNA 呢？为了寻找这样的miRNA，我们认为下面四条标准是必不可少的：首先，它们需要增强肿 瘤细胞对多种药物的敏感性，以便解决临床上观察到的多药耐药性现象；其次，它们可以调 控多条关键的耐药性信号通路，避免因耐药性信号通路的冗余而造成的治疗失败；再次，它 们在肿瘤中要存在遗传学或表观遗传学的变化，而在正常组织中则不存在相应的变化，以 便在治疗过程中可以避免对正常细胞的伤害；最后，这些关键miRNA下游执行功能的重要 基因要能成为分子标志物来指导个性化治疗。
[0004] 事实上目前已经有一些文献报道了 miRNA与肿瘤耐药性的关系。例如，在肝癌 中，miR-221/222能通过靶向抑癌基因PTEN和HMP3来诱导肿瘤细胞对TRAIL的耐受性， miR-199a-3p能通过抑制mTOR和c-Met增强肿瘤细胞对多柔比星的敏感性。这些研究为阐 释miRNA与耐药性的关系奠定了基础，但是到目前为止，尤其是在肝癌和肾癌的研究中，还 没有文章系统地分析过在人类众多的miRNA当中，哪些是调控耐药性的关键因子，也不清 楚如何利用miRNA进行个性化治疗。
[0005] 因此，本领域迫切需要寻找能够增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的方法，并开发 相应的治疗药物。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是寻找提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的关键miRNA。
[0007] 本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受 的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：
[0008] (a). miRNA-27b 家族的微小 RNA，所述 miRNA-27b 家族的微小 RNA 包括：miRNA-27b 或经修饰的miRNA-27b衍生物；或核心序列为5' ucacagu3'、长度为18-26nt、功能与 miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；
[0009] (b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的miRNA-27b ;
[0010] (C).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成（b)中所述的前体miRNA,并加 工形成（a)中所述的微小RNA ;
[0011] (d).表达载体，所述表达载体含有（a)中所述的miRNA-27b、或（b)中所述的前体 miRNA、或（c)中所述的多核苷酸；
[0012] (e). (a)中所述的微小RNA的激动剂。
[0013] 在另一优选例中，（a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/ 或所述的"功能与miRNA-27b相同或基本相同"是指保留了 miRNA-27b的彡40%，且彡500% 的增强肿瘤细胞对药物敏感性的功能。
[0014] 在另一优选例中，所述的miRNA-27b的序列如SEQ ID NO. : 1所示。
[0015] 在另一优选例中，所述的药物组合物还包括任选的抗肿瘤药物。
[0016] 在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物包括：化疗剂、多靶点激酶抑制剂。
[0017] 在另一优选例中，所述的化疗剂包括（但不限于）：多柔比星（Doxorubicin)、表柔 比星（Epirubicin)、依托泊式（Etoposide)、顺钼（Cisplatin)。
[0018] 在另一优选例中，所述的多靶点激酶抑制剂包括（但不限于）索拉菲尼 (Sorafenib)、吉非替尼（Gefitinib)0
[0019] 在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种 修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽 段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。
[0020] 在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-0-甲基的糖基修饰、2-0-甲氧 乙酯的糖基修饰、2-0-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/ 或
[0021] 所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或
[0022] 所述的核酸修饰包括"TT"修饰。
[0023] 在另一优选例中，（a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合 物单体或其多聚体：
[0024] (X) n- (Y) m
[0025] 式 I，
[0026] 在式I中，
[0027] 各X为（a)中所述的微小RNA ;
[0028] 各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；
[0029] Y连接于X的左侦彳、右侧或中间；
[0030] n为1-100的（较佳地1-20)正整数（较佳地n为1、2、3、4或5);
[0031] m为1-1000的（较佳地1-200)正整数；
[0032] 各" "表示接头、化学键、或共价键。
[0033] 在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。
[0034] 在另一优选例中，所述的Y包括（但不限于）胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、月旨 肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。
[0035] 在另一优选例中，（b)所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. :2所示。
[0036] 在另一优选例中，（c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：
[0037] Seq 正向-X-Seq 反向
[0038] 式 II，
[0039] 式 II 中，
[0040] Seq1^1为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；
[0041] 为与Seq1^1基本上互补或完全互补的核苷酸序列；
[0042] X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向 不互补；
[0043] 并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
[0044]
【权利要求】
1. 一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量 的选自下组的一种或多种活性成分： (a). miRNA-2化家族的微小RNA，所述miRNA-2化家族的微小RNA包括；miRNA-2化或经 修饰的miRNA-2化衍生物；或核也序列为5'ucacagu3'、长度为18-26nt、功能与miRNA-2化 相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物； 化).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的miRNA-2化； (C).多核巧酸，所述的多核巧酸能被宿主转录形成化）中所述的前体miRNA,并加工形 成（a)中所述的微小RNA ; (d) .表达载体，所述表达载体含有（a)中所述的miRNA-27b、或化）中所述的前体 miRNA、或（C)中所述的多核巧酸； (e) . (a)中所述的微小RNA的激动剂。
2. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，（a)中所述的核也序列指微小RNA 第2-8位的核巧酸序列；和/或所述的"功能与miRNA-2化相同或基本相同"是指保留了 miRNA-2化的> 40%，且《500%的增强肿瘤细胞对药物敏感性的功能。
3. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的miRNA-2化的序列如SEQ ID NO. : 1所示。
4. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括任选的抗 肿瘤药物。
5. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，（a)中所述经修饰的miRNA衍生物是 具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体： 狂)n-a)m 式I， 在式I中， 各X为（a)中所述的微小RNA ; 各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物； Y连接于X的左侧、右侧或中间； n为1-100的（较佳地1-20)正整数（较佳地n为1、2、3、4或5); m为1-1000的（较佳地1-200)正整数； 各表示接头、化学键、或共价键。
6. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，化）所述的前体miRNA的核巧酸序列 如 SEQ ID NO. :2 所示。
7. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，（C)中所述的多核巧酸具有式II所 示的结构： Seq正向-X-Seq反向 式II， 式II中， SeqE@为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核巧酸序列； Seq&@为与SeqE@基本上互补或完全互补的核巧酸序列； X为位于8日9正@和8日9反@之间的间隔序列，并且所述间隔序列与8日9正@和Seqg@不互 补； 并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：
式 III， 式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述， 表不在8日9正@和Seq_g@之间形成的碱基互补配对关系。
8. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，（d)中所述的表达载体包括；病毒载 体或非病毒载体。
9. 如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，（e)中所述miRNA-2化的激动剂选自 下组；促进miRNA-2化表达的物质、提高miRNA-2化活性的物质。
10. -种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组： (a). miRNA-2化家族的微小RNA，所述miRNA-2化家族的微小RNA包括；miRNA-2化或经 修饰的miRNA-2化衍生物；或核也序列为5'ucacagu3'、长度为18-26nt、功能与miRNA-2化 相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物； 化).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成（a)中所述的miRNA-2化； (C).多核巧酸，所述的多核巧酸能被宿主转录形成化）中所述的前体miRNA,并加工形 成（a)中所述的微小RNA ; (d) .表达载体，所述表达载体含有（a)中所述的miRNA-27b、或化）中所述的前体 miRNA、或（C)中所述的多核巧酸； (e) . (a)中所述的微小RNA的激动剂； 其特征在于，所述活性成分用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的药物、或制备预防 或治疗肿瘤（尤其是耐药性肿瘤）的药物。
11. 如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组；肺癌、肝癌、肾癌、 胃癌、肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌。
12. -种筛选用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物的方法，其特征在于，包括步 骤： (a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-2化 的表达水平； 化）将测试组的miRNA-2化与对照组的miRNA-2化的表达水平进行比较，所述对照组中 未施用所述候选物质； 其中，当测试组的miRNA-2化的表达水平显著高于对照组的miRNA-2化的表达水平时， 则表明该候选物质是用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物。
13. -种微小RNA即miRNA-2化的用途，其特征在于，用于制备进行肿瘤预后和/或判 断肿瘤是否耐药的试剂或试剂盒；其中，所述的试剂盒中包括W下说明： (i) 若检测对象的miRNA-2化的表达量显著低于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤 预后差和/或该检测对象肿瘤耐药可能性大； (ii) 若检测对象的miRNA-2化的表达量正常或显著高于正常水平，则说明该检测对象
的肿瘤预后好和/或该检测对象肿瘤耐药可能性小。
14. 一种miRNA-2化的用途，其特征在于，用于制备P53的激活剂或用于制备CYP1B1的 抑制剂。
【文档编号】C12Q1/68GK104415347SQ201310368487
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年8月21日 优先权日:2013年8月21日
【发明者】惠利健, 慕文婧, 胡超博 申请人:中国科学院上海生命科学研究院