黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明研究了一种黄芪愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控悬浮细胞中酶的活性及黄酮皂苷的含量等步骤，本发明方法所制备的黄芪悬浮细胞中含有较高含量的黄芪皂苷。本发明方法利用稀土对黄芪悬浮细胞进行有目的的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
【专利说明】黄芪愈伤组织和黄芪悬浮细胞的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及组培条件下黄芪悬浮细胞的培养，尤其是稀土硝酸铈对悬浮细胞中黄芪皂苷的调控。
【背景技术】
[0002]黄芪又名绵芪，绵黄芪，为豆科植物膜荚黄芪，为国家三级保护植物，渐危种，主要分布在中国北方地区，是一种较名贵的中药材，以根入药，药用历史悠久，具有补气固表，利尿脱毒，敛疮生肌，益气补中之功效。目前，黄芪的用药量越来越大，但黄芪的天然资源贫乏，栽培过程中由于病虫害的影响，产量和品质有所下降，因此采用基因技术的方法，开发生产黄芪的药用成分，进行黄芪植物资源开发，减少占地的一种新方法。
[0003]黄芪皂苷，英文名称；Astragaloside 分子式=C43H68O16分子量:840.99分子结构:
【权利要求】
1.一种黄芪愈伤组织和悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌外植体的获得、愈伤组织的诱导、悬浮细胞培养、稀土调控黄芪悬浮细胞中黄酮皂苷的含量，其主要步骤如下: (1)按照植物组织培养常规消毒方法对野外采取的外植体材料进行消毒处理，获得无菌的外植体； (2)将步骤(I)获得的无菌黄芪叶片，芽接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导，诱导出来的愈伤组织接种入增值培养基中进行愈伤组织增值，增值培养4-5代，获得嫩绿松散的愈伤组织； (3)将步骤(2)获得的嫩绿松散的愈伤组织接种到附加激素0.5-1.5 mg/L NAA和1_3mg/L IBA的MS培养基中进行震荡悬浮培养，培养2_3代获得黄芪悬浮细胞； (4)将步骤(3)获得的黄芪悬浮细胞接种入MS+lmg/LNAA+2mg/LIBA+稀土 l_3mg/L，收集黄芪悬浮细胞称重，然后分两份，一份-70°C冰箱保存鲜样，一份60°C烘干保存干样。
2.按照权利要求1的制备方法，其特征在于:步骤(I)中所述无菌的黄芪外植体叶片和芽按照下述方法得到:取黄芪叶片和芽，洗衣粉浸泡4分钟，流水冲洗50分钟，经次氯酸钠消毒处理12分钟，无菌水冲洗5遍，用吸水纸吸去无菌外植体表面的水分。
3.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于:所述的培养条件为温度25°C，湿度50%-70%，光强度20001x ;光期14 h暗期10h。
4.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(2)所述的黄芪愈伤组织按照按照下述方法得到:将获得的无菌黄芪叶片和芽切成Icm2小块，接种入MS培养基中进行愈伤组织诱导，每瓶接种4块，附加激素lmg/LNAA，3mg/L2，4_D，蔗糖30g/L，琼脂6.5g/L，pH=8，初代培养30天，连续继代4-5次，继代周期20天，获得嫩绿松散的愈伤组织。
5.按照权利要求1的 制备方法中，其特征在于:步骤(3)所述的黄芪悬浮细胞按照按照下述方法得到:取诱导出来的嫩绿松散的愈伤组织，接种到盛有40 mLMS液体培养基100mL三角瓶中，接种后置于旋转式摇床振荡培养，摇床转速为120 r/min，温度25°C，初次液体培养愈伤组织生长旺盛，摇匀培养液后稍置片刻，用颗粒适中的悬浮细胞团进行继代培养，换用200 mL三角瓶装60 mL液进行培养，再继而用500 mL三角瓶装120 mL液培养，以进行悬浮培养系的诱导。
6.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)所述稀土对黄芪悬浮细胞的调控按照下述方法实施:将l_3mg/l稀土溶液加入诱导出的悬浮培养系中进行调控，25天后取样测定黄芪皂苷的含量，精密称取干样品lg，60°C烘干，研磨后过80目筛，加入65%的乙醇和水1:1，溶液30ml放入超声波中，60°C超声提取45min，过滤弃残渣，使用65%的乙醇定容至100ml，摇匀后，取1.00 mL提取液加入试管，再分别加入1.00 mL 8%香草醛试剂，置于冰浴中缓缓加入10.0mL体积分数为72%的硫酸，摇匀，放入70°C水浴中，保温25 min,取出置于室温冷却，摇匀，立即于波长542 nm处测定吸光度，测定3次求平均值。
7.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)中所述的稀土是硝酸铈稀土。
8.按照权利要求1的制备方法中，其特征在于:步骤(4)中所述的黄芪皂苷提取方法为超声提取法。
【文档编号】C12N5/04GK103451146SQ201310410256
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】苏刘花 申请人:南京泽朗农业发展有限公司