一种高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母及构建方法
【专利摘要】本发明公开了一种高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母及构建方法。该基因重组酿酒酵母是通过对人肝金属硫蛋白基因进行密码子改造，与酿酒酵母表达载体重组并转入酿酒酵母细胞，获得正确的表达而构建成的。该基因重组酿酒酵母有效的提高了酵母细胞对铀（VI）的吸附容量，且具有吸附成本低、生物量可重复使用，不会造成二次污染的特点，对减轻铀污染程度和回收铀资源方面具有积极的推动作用。
【专利说明】一种高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母及构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高效吸附水溶液中铀(VI)的基因重组酿酒酵母，属于环境生物技术应用领域。
【背景技术】
[0002]生物吸附是指对于经过一系列生物化学作用使重金属离子被生物细胞吸附的过程。研究表明，多种微生物被用于重金属离子的生物吸附，包括藻类、细菌、真菌及酵母等。其中，酿酒酵母(SaccAaro焊Ce1S cerevisiae、已被证明对 Cu2+、Cr3+、Pb2+、Hg2+、Cd2+、As3+ 等多种金属离子具有较强的吸附能力，同时具有安全、易于培养和生长的优良特性。微生物吸附成本低、效率高、生物量可重复使用，且不会造成二次污染，在处理含铀废水和回收铀资源方面有着广阔的应用前景。
[0003]对于铀(VI)的生物吸附研究，尽管目前已经取得了一定进展，然而经过多年的研究，铀(VI)的生物吸附容量已经接近饱和，导致生物吸附研究始终停留在经验和实验室阶段，对于实现实用化和工业化应用，目前面临的主要问题是如何进一步提高微生物对铀的生物吸附容量，降低生产成本。
[0004]目前对于微生物吸附包括铀(VI)在内的重金属的研究机制认为，细胞壁是重金属离子的主要积累场所，金属离子可与细胞壁上的活性基团发生定量结合反应。鉴于此，考虑在微生物细胞表面表达金属络合物，增强金属离子在细胞壁上的结合，已成为提高细胞吸附容量的一条有效途径。金属硫蛋白(MTs)就是这类物质最典型的代表，MTs已被证明可以有效的结合Hg2+、Cd2+、Ag+、Zn2+、Cu2+等多种金属阳离子，不同物种及不同亚型的MTs对重金属的吸附能力各不相同，其中人类的金属硫蛋白络合能力最强。
[0005]细胞表面展示技术的原理是将外源肽以融合蛋白的形式固定在细胞的外膜，被表达的多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使表达、纯化、固定于一体，在医药、食品、生物燃料、环境保护等多个领域都有广泛的应用前景。近两年来，很多学者已经将生物吸附的研究重心转移到将金属结合蛋白表达到微生物细胞外膜表面，解决重金属生物吸附的容量问题，这一领域已经逐渐成为目前生物吸附的研究热点。
[0006]截止目前，对于在酿酒酵母细胞外膜表达MTs是否可以提高对铀(VI)的生物吸附容量，国内外尚未见相关报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种表面展示金属硫蛋白的重组酿酒酵母，通过在细胞表面表达金属硫蛋白，增强铀(VI)在细胞壁上的络合，达到提高细胞吸附容量的目的。
[0008]所述金属硫蛋白基因克隆于载体PYDI,并转化到酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae ) EBY100 中。
[0009]为解决上述技术问题，本发明的具体方案为:1)改造人肝金属硫蛋白基因编码序列，合成该基因；
2)将金属硫蛋白基因与酿酒酵母表面展示载体连接，得到重组表达载体；
3)将重组表达载体转化到酿酒酵母cerevisiae)EBYlOO中，得到基因重组酿酒酵母。
[0010]下面是本发明技术方案的具体描述:
质粒及基因重组酿酒酵母的构建:
根据Genebank数据库中公布的人肝金属硫蛋白基因编码序列，经密码子改造后，进行全基因合成；将人工合成的金属硫蛋白基因克隆到质粒pYDl (购自Invitrogen生物技术有限公司，货号:V835-01)构建表面展不表达载体；将构建好的表达载体转化酿酒酵母 EBYlOO (MATa ura3_52 trpl leu2Al his3A200 pep4::HIS3 prblAl.6Rcanl GAL (pIU211: URA3))。PCR (Pl:5’ -ATGGACCCAAACTGCTCCTGCGCTA-3’ ；P2:5’ -AGCACAGCAAGAGCACTTTTCTGAT-3’ )验证阳性转化子。
[0011]重组酵母EBY100-MT细胞的培养:
种子培养基:0.67 (w/v)YNB (含硫酸铵，不含氨基酸)，0.5% (w/v)水解酪蛋白氨基酸，2% (w/v)葡萄糖。固体培养基添加2% (w/v)的琼脂粉。
[0012]发酵培养基:0.67 (w/v)YNB (含硫酸铵，不含氨基酸)，0.5% (w/v)水解酪蛋白氨基酸，2% (界八)半乳糖，1151:灭菌201^11。
[0013]从斜面中接种重组酿酒酵母单菌落于IOml的种子培养基中，30°C，180rpm过夜培养至0D600在2-5之间，离心收集细胞并用无菌水洗涤，接种至发酵培养基中，至0D600为
0.5-1，于20°C，180rpm震荡培养36-48h。细胞经离心、洗涤、冻干，用于水溶液中铀(VI)的吸附。
[0014]吸附实验:
称取0.01 g基因重组酿酒酵母EBY100-MT细胞，加入50mL—定浓度的铀(VI)溶液中，密封振荡，离心取上清液，用偶氮胂III法测定其铀(VI)浓度，如下公式计算吸附量:
【权利要求】
1.一种高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母，其特征在于含有外源金属硫蛋白基因。
2.权利要求1所述的高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母的构建方法，其特征在于包括如下步骤: 51.按照酿酒酵母的密码子使用规律，改造人肝金属硫蛋白基因编码序列，合成该基因； 52.将金属硫蛋白基因与酿酒酵母表面展示载体连接，构建重组表达载体； 53.将上述构建得到的重组表达载体转化到酿酒酵母(cerevisiae)EBYlOO中，构建基因重组酿酒酵母。
3.根据权利要求1所述的高效吸附水溶液中铀的基因重组酿酒酵母应用于水溶液中铀(VI)的吸附。`
【文档编号】C12R1/865GK103525713SQ201310423531
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年9月17日 优先权日:2013年9月17日
【发明者】李敏, 梁波, 张志斌, 徐琼, 于梁梁 申请人:东华理工大学