用于与egfr基因杂交的dna探针库及采用其富集egfr基因片段的方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列：SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6、SEQ?ID?NO.7、SEQ?ID?NO.8、SEQ?ID?NO.9、或SEQ?ID?NO.10。本发明还提供了采用该DNA探针库富集EGFR基因片段的方法。基于此，本发明还提供了一种检测EGFR基因的基因结构突变的方法。采用本发明的方法可以成数千倍、甚至上万倍地富集得到EGFR基因片段，并可以将其用于下一代测序技术以进行基因结构突变的检测，包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
【专利说明】用于与EGFR基因杂交的DNA探针库及采用其富集EGFR基因片段的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因检测领域，具体而言，本发明涉及一种EGFR基因片段的富集和提取方法，所述方法可以精准地富集EGFR基因片段，进而可以选择性地进行EGFR基因结构突变的检测。
【背景技术】
[0002]DNA测序技术正处在天翻地覆的剧变中，其突出特点为同时对众多的位点进行观察分析(大规模平行)，从而逐步实现测序通量的大幅增长，原始数据中每个碱基的测序成本的急剧下跌。基于此，以前高不可攀的奢侈性活动(如个人基因测序、宏基因组学研究)，逐渐变得越来越切实可行。特别是随着科学的发展，由于传统的Sanger测序已经不能完全满足研究的需要，下一代测序技术(第二代测序技术，Next-generation sequencing)应运而生。
[0003]下一代测序技术是同步化三磷酸核苷酸的洗脱方法和同步化的光学检测方法的结合。例如采用以鲁米那(Illumina)提供的仪器，以短的连续性的片段序列和测序阅读长度的形式，每周输出数亿以计的碱基的DNA序列。这是一种由DNA连接酶和聚合酶主导化学过程的第二代测序方法，DNA序列将会用生物信息学的方法拼接还原。在成本方面，下一代测序技术比第一代测序技术大体上降低了 1000倍，并且还正以指数级的速度下降。目前下一代测序技术已经广泛应用于全基因组测序，但是在其它基因分析领域，例如特定基因结构突变的检测等方面尚未得到充分开发。
[0004]基因检测是利用血液、其他体液或细胞对核酸进行检测的技术，其通过特定设备对被检测者核酸分子信息作检测，分析它所含有的各种基因情况，从而使人们能了解自己的基因信息，判断身体患有疾病的情况或风险，从而可适应性地选择疾病治疗方案，甚至预防疾病的发生。
[0005]现有的基因突变检测方法还主要集中于以下3个技术:
[0006]1)PCR突变检测
[0007]基于PCR片段扩增和凝胶电泳分离的方法，从而分辨出野生型和突变性的差异。其缺点包括:其为单碱基突变类型检测，不能对mRNA进行定量，不能检测基因颠换；敏感性低；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化；无法进行高通量检测。
[0008]2) Q-PCR (定量 PCR)检测
[0009]基于荧光和PCR片段扩增来对模板mRNA多少来进行定量。其缺点包括:不能检测单碱基类型突变；不能检测基因颠换；只能检测已知突变；耗时长，单次只能检测一个基因突变；不能确定碱基的具体变化。
[0010]3)基因芯片技术
[0011]用高精度技术将·DNA片段打印在芯片上，然后通过DNA杂交结合特性来确定突变性质。其缺点包括:不能检测基因颠换；只能检测已知突变；成本高，通量较小；准确率低，通常需要重复2次以上才能确定结果。
[0012]因此可知，目前在基因检测技术方面尚缺少更为全面、快速、简便、准确的检测方法，特别是在目前拥有下一代测序技术这种以高通量、低成本基因测序为特点的技术的情况下，如何基于下一代测序技术开发新型基因检测和筛查技术，是本领域研究人员广泛关注的问题。并且，如果应用下一代测序技术来检测基因的结构突变情况，如何获得能够满足下一代测序技术要求的基因检测样本，也是期待解决的一个技术问题。
[0013]EGFR是一种可以激活细胞增殖的穿膜信号蛋白。受到上皮生长因子刺激时，会与EGFR家族的其他成员或者自身形成蛋白双体，从而激活它自身的酪氨酸激酶活性，启动其下游的一系列传导因子的磷酸化。EGFR的下方通路包括MAPK和PI3K-AKT等。因此，EGFR在调节肿瘤细胞的生长、修复和生存、新生血管生成、侵袭和转移中都具有重要的作用，同时在三分之二的人类肿瘤中都有广泛表达。各种研究都表明，EGFR突变/表达增加在多种癌症中扮演重要角色，如非小细胞肺癌類，前列腺癌，乳腺癌，卵巢癌以及大肠癌。此外，在很多恶性肿瘤中，EGFR的表达往往与较差的预后和较低的生存率相关。
[0014]目前已经开发了多种针对EGFR突变的单抗体，或者作为小分子抑制剂来隔断癌症细胞表面EGFR受体与受质的相互作用，或者抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，从而既能减缓或者抑制癌细胞生长，也能增加化疗和放疗的抗肿瘤功效。目前针对EGFR的肿瘤药物主要有西妥昔单抗(Cetuximab)、帕尼单抗(Panitumumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、以及小分子EGFR酪氨酸激酶抑制剂易瑞沙(Gefitinib)、特罗凯(Erlotinib)和TO168393。
[0015]检测EGFR基因突变，对判断肿瘤的发生发展、治疗药物的选择等方面均有重要意义。
【发明内容】
[0016]针对上述技术问题，本发明人通过大量实验，开发了基于杂交选择而捕获EGFR基因片段序列的方法，采用该方法可以获得成几千倍、甚至上万倍富集的EGFR基因片段，该经富集的EGFR基因片段样本可以选择`性地应用于各种基因检测技术，特别是可以应用下一代测序技术进行基因突变、缺失、增加、和颠换等方面的检测。
[0017]具体而言，本发明的技术方案如下:
[0018]一方面，本发明提供了一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列:
[0019]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0020]优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示:
[0021]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0022]另一方面，本发明提供一种富集EGFR基因片段的方法，所述方法包括以下步骤:
[0023]1)获得受试者的DNA样本库；
[0024]2)获得能够与EGFR基因杂交的DNA探针库；
[0025]3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和[0026]4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的EGFR基因片段。
[0027]其中，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括:
[0028]1-1)提取受试者的全基因组DNA，然后将其片段化；或者
[0029]1-2)提取受试者的mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链 cDNA ；
[0030]其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA ； [0031]优选地，所述DNA片段的长度为150_600bp ；
[0032]进一步优选地，所述DNA片段的长度为150_200bp。
[0033]所述步骤2)中的DNA探针库为如上所述的DNA探针库。具体而言，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列:
[0034]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0035]优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示:
[0036]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0037]此外，所述步骤3 )包括:
[0038]3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针；和
[0039]3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交；
[0040]优选地，所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素；进一步优选地，所述步骤3-2)包括在PCR扩增仪中，在65°C下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
[0041 ] 因此，所述方法的步骤4)中，优选利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物。进一步优选地，所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素，所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
[0042]另一方面，本发明还提供一种检测EGFR基因的基因结构突变的方法，所述方法包括以下步骤:
[0043]1)根据上述方法富集EGFR基因片段；和
[0044]2)检测所述EGFR基因的基因结构突变。
[0045]优选地，所述步骤2)中采用下一代测序技术，通过对富集到的EGFR基因片段进行测序而检测所述EGFR基因的结构突变。
[0046]又一方面，本发明提供一种用于富集EGFR基因片段的试剂盒，所述试剂盒包含上述的DNA探针库。具体而言，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列:
[0047]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；
[0048]优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示:
[0049]SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ IDN0.6, SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
[0050]以下是本发明的详细描述:[0051]本发明提供一种富集EGFR基因片段的方法。具体而言，本发明的方法包括:从哺乳动物例如人的细胞、体液或组织样本中提取基因组DNA或mRNA，经处理或合成cDNA，从而获得片段化的双链DNA作为DNA样本库；此外，针对要富集的EGFR基因，设计与该EGFR基因杂交的DNA探针，从中筛选出多个探针作为DNA探针库；然后，将该DNA样本库与DNA探针库进行杂交，从而从DNA样本库中富集得到EGFR基因片段。根据本发明的【具体实施方式】，可以先将DNA探针库中的各个探针进行生物素化，然后在杂交后用链霉亲和素磁珠吸附杂交产物，再从磁珠上释放出富集的EGFR基因片段。经适应性处理，可以采用下一代测序基因对EGFR基因进行基因结构突变的检测，包括单碱基突变、mRNA缺失或增多、mRNA结构颠换、mRNA剪接变化。
[0052]下面以富集得到的EGFR基因片段用于基于下一代测序技术的基因结构突变检测为例，示例性地说明本发明，其中总体工艺流程见图1。
[0053]一、准备 mRNA / DNA 样本库
[0054]1.准备基因组DNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自全基因组的DNA样本库”)
[0055]1.1DNA 提取
[0056]DNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
[0057]使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测DNA模板质量和浓度。dsDNA模板260nm吸光率大于0.0 5以上，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
[0058]1.2DNA 片段化
[0059]将3微克高质量的基因组DNA用低TE缓冲液稀释至120微升。按照组织匀浆机使用说明书，将DNA片段化，片段长度为150-200碱基。
[0060]DNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
[0061 ] 1.3DNA样本库质量检测
[0062]用生物分析仪进行DNA定性定量分析，确认DNA片段长度峰值合理。
[0063]2.准备cDNA样本(采用此种方式获得的DNA样本库称为“源自mRNA的DNA样本库”即cDNA样本库)
[0064]2.1mRNA 提取
[0065]mRNA提取，包括新鲜组织，新鲜血液和细胞，固定和石蜡样本，商业化公司提取试剂盒。以上均按说明书指示方法操作。
[0066]使用分光光度定量仪以及凝胶电泳系统检测mRNA质量和浓度，吸光率A260/A280比值在1.8到2之间为合格。
[0067]2.2mRNA 片段化
[0068]采用NEBNext RNA Fragmentation系统或者其他商业化公司mRNA片段化试剂盒。
[0069]mRNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒
[0070]2.3用商业化公司cDNA合成试剂盒进行mRNA合成第一链以及第二链cDNA。
[0071]cDNA过柱纯化,商业化公司纯化试剂盒。
[0072]3.cDNA / DNA 末端修补
[0073]利用T4聚合酶及Klenow大肠杆菌聚合酶片断，对于cDNA/DNA5’突出粘末端补平以及3’突出粘末端打平，产生平末端，用于后续的平端连接。反应在PCR扩增仪中进行，20摄氏度，30分钟。
[0074]
【权利要求】
1.一种用于与EGFR基因杂交的DNA探针库，其特征在于，所述DNA探针库包括一个或多个能够与EGFR基因杂交的DNA探针，所述DNA探针包含以下序列:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7、SEQ ID N0.8、SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10 ；优选地，所述DNA探针的序列如以下序列所示:SEQ ID N0.1、SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4、SEQ ID N0.5、SEQ ID N0.6、SEQ ID N0.7, SEQ ID N0.8, SEQ ID N0.9、或 SEQ ID N0.10。
2.一种富集EGFR基因片段的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:1)获得受试者的DNA样本库；2)获得能够与EGFR基因杂交的DNA探针库；3)使所述DNA探针库与所述DNA样本库进行杂交；和4)分离步骤3)的杂交产物，然后释放经杂交富集的EGFR基因片段。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的DNA样本库由双链DNA片段组成，并且，所述步骤1)包括:1-1)提取受试者的全基因组DNA，然后将其片段化；或者1-2)提取受试者的mRNA，将其片段化，然后以该经片段化的mRNA为模板合成双链cDNA ；`其中，所述受试者为哺乳动物，优选人，且从受试者的细胞、组织或体液样本中提取全基因组DNA或mRNA ；优选地，所述DNA片段的长度为150-600bp ；进一步优选地，所述DNA片段的长度为150-200bp。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的DNA探针库为根据权利要求1所述的DNA探针库。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)包括:3-1)采用选择性标记标记DNA探针库中的DNA探针；和3-2)使所述DNA探针库与DNA样本库进行杂交；优选地，所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素；进一步优选地，所述步骤3-2)包括在PCR扩增仪中，在65°C下将所述DNA探针库与DNA样本库孵育24小时。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中利用DNA探针上的选择性标记分离杂交产物；优选地，所述步骤3-1)中的选择性标记为生物素，所述步骤4)中利用链霉亲和素-生物素的亲和作用分离杂交产物。
7.—种检测EGFR基因的基因结构突变的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤:1)根据权利要求1至6中任一项所述的方法富集EGFR基因片段；和2)检测所述EGFR基因的基因结构突变。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中采用下一代测序技术，通过对富集到的EGFR基因片段进行测序而检测所述EGFR基因的结构突变。
9.一种用于富集EGFR基因片段的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含根据权利要求1所述的DNA探针库 。
【文档编号】C12N15/10GK103667270SQ201310430173
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2012年9月18日
【发明者】邵阳 申请人:邵阳