一种结核分枝杆菌分泌性抗原Mce3E及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种结核分枝杆菌分泌性抗原Mce3E及其应用，属于免疫检测领域。本发明通过构建基因工程菌重组表达获得了Mce3E抗原蛋白，并利用ELISA技术检测临床不同分类人群的血清中针对这些抗原的抗体反应强度，确定了Mce3E抗原在结核病例中的反应的灵敏度和特异性。所得Mce3E抗原具有很好的特异性，能够有效区分BCG接种健康人群和结核菌感染者，可以辅助结核病临床诊断，该方法操作简单、灵敏度高、特异性强，具有较高的临床应用价值。
【专利说明】—种结核分枝杆菌分泌性抗原Mce3E及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种结核分枝杆菌分泌性抗原Mce3E及其应用，属于免疫检测领域。【背景技术】
[0002]结核病是由结核分枝杆菌感染所致，目前全球60亿人约有20亿感染了结核分枝杆菌，现有结核病患者2000万，每年死亡300万，结核病已成为单一因素导致死亡的传染病的头号杀手。我国为全球22个结核病疫情严重的国家之一，年发病人数约为130万，占全球发病的17%，位居全球第2位。能及时准确的诊断结核病一直是控制结核的重要组成部分。目前在中国最常用的免疫学诊断方法是结核菌素皮试(tuberculin skin test, TST)法，但由于包含许多与BCG和其他环境分枝杆菌交叉的抗原，其特异性并不十分理想；传统的痰涂片显微镜镜检和细菌培养也需要很长的培养时间，而且约10%-20%的病例结核杆菌培养失败，因此研发一种能够准确、快捷、特异并且价格合理地诊断活动性结核和结核潜伏感染的方法迫在眉睫。
[0003]结核分枝杆菌与卡介苗差异区域(RD区)抗原是筛选特异性抗原应用于结核免疫诊断和疫苗研制的热点区域。根据两个重要的RDl区抗原ESAT-6和CFPlO所研发的分别基于酶联免疫斑点技术和酶联免疫吸附技术的两种结核诊断试剂盒已经在发达国家开始使用，但在结核病患者居高不下的中国并没有该类检测方法问世。
[0004]血清学诊断法快速、操作简单、而且不需要活细胞，这些优势都是基于细胞免疫反应的诊断方法不可比拟的。但截至目前，中国在结核病的诊断过程中还没有哪一种血清学诊断方法的敏感性和特异性令人十分满意。虽然ESAT-6和CFPlO已经被证实可以作为一种诊断抗原辅助结核病的临床诊断，但是由于专利保护导致我国使用成本高昂，而且由于不同结核病人的抗体反应具有很大的差异性，研究者普遍认为将来的血清学诊断试剂可以包括几种不同的抗原来达到较好 的诊断效果。
[0005]本发明提供了一种新的有效的结核分枝杆菌特异性抗原，通过ELISA间接法表明该抗原在结核分枝杆菌感染血清学诊断方面具有较高的灵敏度和特异性。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题是提供一种可用于结核分枝杆菌检测的抗原蛋白Mce3E，其氨基酸序列如(a)或(b)或(C):
[0007](a) SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
[0008](b )在(a )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的由(a)衍生的多肽或其类似物；
[0009](C)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。
[0010]所述Mce3E抗原的制备方法是构建含有编码Mce3E抗原的基因的重组质粒pGEX-6P-l-mCe3E，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中，以IPTG诱导蛋白表达；超声破菌，高速离心后收取上清液；将上清液缓缓流过Glutathione Sepharose4B填充柱,然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤，最后加入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；将收集的洗脱液加入到30KD的蛋白浓缩管(millipore)中，3500rpm离心浓缩20分钟；在蛋白浓缩管中加入2mlPBS混匀后离心；分装蛋白，-80°C保存待用。
[0011]本发明要解决的另一个技术问题是提供一种结核分枝杆菌特异性检测试剂盒，含有所述的抗原蛋白Mce3E、编码所述蛋白的DNA分子、含有编码所述蛋白的DNA分子的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其中任意一种。该试剂盒可以是，包括所述抗原蛋白、96孔EIA/RIA酶标板、待测血清样品(一抗)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗人抗体(二抗)及辣根过氧化物酶显色底物、其他ELISA检测所需试剂及耗材。
[0012]所述Mce3E可应用于制备ELISP0T法检测结核分枝杆菌特异性T细胞的试剂盒。
[0013]所述Mce3E可应用于制备ELISA双抗体夹心法特异性检测结核分枝杆菌的试剂盒。
[0014]所述Mce3E可应用于制备免疫胶体金技术或流式细胞分析特异性检测结核分枝杆菌的试剂盒。
[0015]Mce3E蛋白是位于结核分枝杆菌mce3操纵子中的一个分泌性蛋白，在活动性结核菌中Mce3E蛋白活性非常高。本发明结合中国结核流行病学特征提供了新的血清学诊断抗原Mce3E (Rvl970)，其在结核病诊断中的灵敏性和特异性。Mce3E位于RD15区，而在中国接种的卡介苗菌株(BCG China)中缺失该区段，因此Mce3E抗原具有很好的特异性，能够有效区分BCG接种健康人群和结核菌感染者。可以辅助结核病临床诊断，该方法操作简单、灵敏度高、特异性强，具有较高的临床应用价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1实验组及各对照组设计方案示例。
[0017]图2两组样本的ELISA实验结果对比；A，包被GST_Mce3E蛋白的实验组样本的ELISA结果对比；B，包被BL21总蛋白的实验对照组样本的ELISA结果对比。
[0018]图3活动性结核患者和正常志愿者两组样本的ELISA实验结果统计。
【具体实施方式】
[0019]实施例1可用于结核分枝杆菌检测的抗原
[0020]可用于结核分枝杆菌检测的抗原Mce3E(Rvl970)，其氨基酸组序列如SEQ ID NO:1所示。实施例2抗原应用于检测试剂盒的开发
[0021]本专利所保护的抗原可用于结核分枝杆菌感染的诊断，形成临床或实验室诊断用试剂盒。
[0022]检测试剂盒包含4个部分:1.实施例中的抗原蛋白；2.96孔EIA/RIA酶标板；
3.待测血清样品(一抗)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗人抗体(二抗)及辣根过氧化物酶显色底物；4.其他ELISA检测所需试剂及耗材。
[0023]实施例3Mce3E抗原应用于结核分枝杆菌感染临床检测
[0024]本发明选取了活动性结核病人50例以及BCG接种的健康人50例作为对照人群，分别采集全血标本并分离获得血清。然后在原核表达系统中进行克隆表达纯化得到重组蛋白Mce3E，进而利用ELISA技术检测临床不同分类人群的血清中针对这些抗原的抗体反应强度，来确定Mce3E抗原在结核病例中的反应的灵敏度和特异性评价其用于临床诊断的可行性。[0025]A.抗原制备
[0026]I)构建含有编码Mce3E抗原的基因的重组质粒pGEX-6P-l-mce3E，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中；
[0027]2)将携带质粒的大肠杆菌BL21在30°C条件下加入IPTG诱导蛋白表达，诱导时间为4小时；
[0028]3)超声破菌，高速离心后收取上清液；
[0029]4)将上清液缓缓流过Glutathione Sepharose4B填充柱,然后加入柱洗漆缓冲液充分洗涤柱子，最后加入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；
[0030]5)将收集的洗脱液加入到30KD的蛋白浓缩管(millipore)中，3500rpm离心浓缩20分钟；
[0031]6)在蛋白浓缩管中加入2mlPBS混匀后同步骤5)重复离心；
[0032]7)分装蛋白，_80°C保存待用。
[0033]B.血清采集
[0034]本发明所涉及结核病患者病例筛选标准为:
[0035]I)、临床主治医生根据患者临床表现确诊为肺结核；
[0036]2)、结核分枝杆菌分尚培养菌落呈阳性；
[0037]3)、X射线影像呈现肺部病变；
[0038]4)、结核菌素皮下试验结果为阳性，斑点直径大于1cm。
[0039]此外选择了正常人的血清作为实验对照。
[0040]血清的采集方法:收集的血液凝固后离心4000rpm，IOmin获取血清，收集的血清样本分装并储存于-20度保存待用。
[0041]C.ELISA间接法检测结核分枝杆菌感染
[0042]实验组及各对照组设计方案示例参见图1。
[0043]I)实验组用包被缓冲液(0.85mol/L碳酸盐缓冲液pH9.6)稀释抗原蛋白浓度为10ug/ml, IOOul/孔加入到酶标板包被蛋白，4°C过夜；实验阴性对照组采用用BL21总蛋白包被；同时还要另外设计一组系统阴性对照(不加入一抗作为对照)和一组系统阳性对照(一抗使用抗包被蛋白的抗体)。
[0044]2)次日弃掉(或者37°C包被2h)孔内残余包被缓冲液，并用洗涤缓冲液(磷酸盐缓冲盐溶液PBST pH7.4)洗板至少3次，5min/次，拍干；
[0045]3)每孔加入150ul/孔封闭液(10%脱脂奶粉)，37°C孵育l_2h ；
[0046]4)加入洗涤缓冲液洗板3次，再分别加入适当用封闭液稀释的待检抗体IOOul/孔(设立阴性对照与阳性对照)，37°C孵育Ih.；
[0047]5)加入洗涤缓冲液洗板5次，每孔加入IOOul辣根过氧化物酶标记的二抗37°C孵育 lh。(羊抗人 IgG (H+U-HRP，中杉金桥货号 ZB-2304，稀释 1:5000-1:10000);
[0048]6)加入洗涤缓冲液洗板5次，拍干后每孔加入IOOul底物显色液，室温避光反应5_15min ；[0049]7)每孔加入50ul终止液终止显色反应，用酶标仪在450nm条件下测量每孔OD值。
[0050]D.结果分析
[0051]阳性反应判断标准:实验血清样本分为两组，分别来自于活动性结核患者(ρ+样本编号)和正常志愿者(d+样本编号)。首先对两组独立样本分别进行正态性分析；正态分布的情况下进一步通过SPSS的T-检验分析得到两组样本间的概率P值和显著性水平比较。当概率P值大于0.05时可以认为两组样本的方差无显著差异，即通过了 Levene方差齐检验；最后通过双尾概率P值判断显著性水平，在显著性水平为0.05的情况下，双尾概率水平小于0.05时表不两组样本的均值存在显著差异。
[0052]本发明涉及经过严格标准筛选的活动性结核患者50例和正常志愿者50例，通过ELISA实验得到两组样本的ELISA实验OD值及统计结果(图2、3)，然后通过SPSS对两独立样本进行T检验，得到的结果显示活动性结核患者组ELISA平均OD值为0.7758，明显高于正常志愿者组的平均OD值0.4698 (表1 )，此外分析显示两个总体的概率P值为0.557，通过了 Levene方差齐性检验；其对应的双尾概率P值为0.000,即两组样本之间存在极显著差异(表2，该结果说明活动性结核患者的血清中普遍有高浓度的Mce3E特异性抗体存在。因此，通过ELISA技术检测血清中的Mce3E抗体强度可以作为区分样本供体是否是结核分枝杆菌感染患者的参考方法。Mce3E是继ESAT-6和CFPlO之后发现的又一个结核诊断抗原。
[0053]表1活动性结核患者和正常志愿者两组样本T检验的基本描述统计量
[0054]`
【权利要求】
1.一种结核分枝杆菌分泌性抗原Mce3E，其特征在于，其氨基酸序列如(a)或(b)或(c)所示:
(a) SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (b )在(a )中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有相同抗原性的由(a)衍生的多肽或其类似物； (C)与(a)、(b)中氨基酸序列整体相似度在85%以上的由(a)衍生的多肽或其类似物。
2.编码权利要求1所述抗原蛋白的DNA。
3.携带权利要求2所述DNA的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
4.权利要求1所述抗原Mce3E的制备，其特征在于，构建含有编码Mce3E抗原的基因的重组质粒pGEX-6P-l-mce3E，并将质粒转化到大肠杆菌BL21中，以IPTG诱导蛋白表达；超声破菌，高速离心后收取上清液；将上清液缓缓流过填充好的Glutathione Sepharose4B,然后加入柱洗涤缓冲液充分洗涤柱子，最后加入2-3ml洗脱液洗脱蛋白；将收集的洗脱液加入到30KD的蛋白浓缩管中，3500rpm离心浓缩20分钟；在蛋白浓缩管中加入2mlPBS混匀后重复离心；分装蛋白，_80°C保存待用。
5.一种结核分枝杆菌特异性检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的抗原蛋白、权利要求2所述DNA分子、权利要求3所述的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌的组合或其中任意一种。
6.权利要求1所述抗原在制备检测结核分枝杆菌的试剂盒中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述试剂盒可以是通过ELISA间接法、ELISA双抗体夹心法、免疫胶体金技术或流式细胞分析特异性检测结核分枝杆菌或结核分枝杆菌特异性T细胞的试剂盒。
【文档编号】C12N15/70GK103483434SQ201310429880
【公开日】2014年1月1日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】刘翠华, 汪静, 许光华, 王琪 申请人:中国科学院微生物研究所