一种蛋白激酶的活性检测方法及其抑制剂筛选方法

一种蛋白激酶的活性检测方法及其抑制剂筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种RIP3蛋白激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒。本发明所述RIP3蛋白激酶活性检测方法无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作。利用本发明所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法，能够高效特异地筛选RIP3蛋白激酶抑制剂，并发现索拉菲尼和威罗菲尼具有RIP3蛋白激酶抑制活性。本发明所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的试剂盒具有特异性高，使用方法简便的优点。
【专利说明】一种蛋白激酶的活性检测方法及其抑制剂筛选方法

【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种RIP3蛋白激酶的活性检测方法以及 RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法。

【背景技术】
[0002] 受体相互作用蛋白家族（receptor-interacting proteins, RIPs)是蛋白激酶家 族的一个重要分支，其功能上具有特异的丝氨酸（Ser)/苏氨酸（Thr)激酶活性，属于Ser/ Thr蛋白激酶家族。，目前用于蛋白激酶活性检测的方法主要包括以下几类：
[0003] 1.基于抗原抗体原理的ELISA方法，通过用蛋白激酶底物包被多孔板板底，加入 激酶及反应液反应后，分别用针对磷酸化底物的抗体(一抗）以及针对一抗的抗体(二抗）进 行孵育，通过化学发光等方式检测激酶催化底物磷酸化的程度，从而评价其活性并用于抑 制剂筛选。但受蛋白纯化程度以及底物自身磷酸化影响，无法排除非特异性磷酸化的干扰， 影响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性。此外该方法价格昂贵、耗时长、操作步骤 多，制约了化合物的高通量筛选。
[0004] 2.放射性同位素标记法，蛋白激酶可催化P32标记的ATP反应从而将P 32基团转移 到底物对其进行标记，通过放射自显影检测底物被P32标记的程度评价酶活及抑制剂对酶 促反应的抑制程度。该方法特异性程度高，但缺点显著，包括对研究场所有严格限制，易造 成环境污染，对研究者健康有潜在危害，且难以实现抑制剂的高通量筛选。
[0005] 该方法是目前用于RIP3(受体相互作用蛋白-3)酶活检测及抑制剂筛选的唯一 方法。具体方法为从Jurkat细胞裂解液中用免疫沉淀法得到RIP3蛋白，在反应液中和 10 y Ci [32P] y -ATP和5 y g MBP在30°C孵育30分钟，随后进行放射自显影。反应液成分 为：20mM HEPES[pH7. 5], 2mM DTT,lmM NaF,lmM Na3V04,20mMP-glycerophosphate, 20mM MgCl2,20mM MnCl2，lmM EDTA，300iiM ATP。
[0006] 3. ATP消耗法，该方法主要包括两步反应，第一步反应是蛋白激酶催化酶促反应消 耗反应体系中的ATP用于磷酸化底物，该反应中部分ATP被转化为ADP ;第二步反应是利用 荧光素酶消耗特定激酶酶促反应后剩余的ATP氧化荧光素氧同时发出荧光。其作用原理如 图1所示，将一定量的特定蛋白激酶与底物置于反应缓冲液中，加入ATP后在一定条件下进 行酶促反应，反应一定时间后，终止激酶反应并启动荧光素酶消耗ATP的氧化反应以释放 荧光。在一定范围内酶促反应后ATP剩余量与荧光强度成线性正相关，而特定激酶催化的 酶促反应程度又与ATP剩余量成线性负相关。若荧光强度强，表明激酶催化反应后体系中 剩余ATP多，说明酶促反应消耗掉的ATP较少，酶促反应程度弱。若荧光强度弱，表明激酶 催化反应后体系中剩余ATP少，说明酶促反应消耗ATP多，酶促反应程度强。因而荧光强度 与酶促反应成线性负相关，可通过检测荧光强度来评价酶促反应的程度。但由于蛋白纯化 过程中无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，影 响激酶活性检测和抑制剂活性检测的准确性和精确性。
[0007] ATP消耗法被用于多种激酶检测，但目前针对RIP3蛋白（受体相互作用蛋白-3) 仍有以下问题未解决：1. RIP3蛋白属于RIP蛋白家族，为丝苏氨酸激酶，与其它家族丝苏氨 酸激酶相比，一级结构具有显著差异，并且目前晶体结构未知。除放射性同位素法外，至今 尚无其它酶活检测方法报道；2. ATP消耗法方法本身存在一定局限性，如蛋白纯化过程中 无法避免的会有非特异性蛋白残留，会在酶促反应中引入非特异性的ATP消耗，此外包括 底物浓度、ATP浓度、反应温度、反应时间等因素，均会影响目标蛋白酶活，因而无法直接用 于抑制剂筛选；3.目前尚未发现针对RIP3的抑制剂。


【发明内容】

[0008] 因此，本发明所要解决的技术问题是针对目前RIP3蛋白激酶活检测方法较为局 限，ATP消耗法方法无法直接用于RIP3蛋白激酶抑制剂筛选的问题，提供了一种RIP3蛋白 激酶活性检测方法，一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法以及一种筛选RIP3蛋白激酶抑 制剂的试剂盒。
[0009] 为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之一为：一种RIP3蛋白激酶抑制剂 的筛选方法，其中所述筛选方法包括以下步骤：
[0010] (1)配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6. 5?7. 0,在该反应缓冲液中加 入RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制 成反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/ill?30ng/ill，RIP3蛋白 激酶浓度为5U/ iil，ATP浓度为10 y M?20 y M，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为 20°C?30°C，反应时间为60?90分钟；
[0011] (2)检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋 白激酶抑制剂的抑制率。
[0012] 其中步骤（1)所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基)丙磺酸5mM?10mM， MgCl 22. 5mM ?5mM，MnCl22. 5mM ?5mM，EDTAO. 4mM ?ImM，EGTAO. 4mM ?ImM，3 -丙三醇-磷 酸盐2. 5mM?5mM和二硫苏糖醇0. 02mM?0. ImM ;较佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸10mM， MgCl25mM，MnCl22. 5mM，EDTA0. 4mM，EGTAlmM，3 -丙三醇-磷酸盐 2. 5mM，二硫苏糖醇 0? 05mM， 所述反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白的浓度更佳地为30ng/iil，ATP的浓度更佳地为10 iiM。
[0013] 其中步骤（1)所述反应体系溶液pH更佳地为7.0,反应温度更佳地为25°C，震荡 速度较佳地为50?100RPM，更佳地为100RPM，反应时间更佳地为75分钟。
[0014] 其中步骤（2)所述检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度的方法为本领域 常规方法，较佳地为利用荧光信号进行检测。所述的方法较佳地包括以下步骤：向步骤（1) 所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶并检测发光信号。该检测方法可以利用各种市 售突光检测试剂盒检测，所述突光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo突光 检测试剂盒。根据所得发光值计算特异性反应率，所得特异性反应率％=(无MBP时的发光 值-有MBP时的发光值）/无MBP时的发光值X 100%。
[0015] 步骤（2)所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法较佳地包 括以下步骤：反应结束后将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加 入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的 抑制率％=(空白组特异性反应率-加药组特异性反应率）/空白组特异性反应率X 100%。
[0016] 为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之二为：一种筛选RIP3蛋白激酶抑 制剂的试剂盒，其中所述试剂盒包括RIP3蛋白激酶、髓鞘碱性蛋白、反应缓冲液、ATP、荧光 素和荧光素酶。
[0017] 其中所述反应缓冲液较佳地包括以下组分：3-(N-吗啉基)丙磺酸10mM，MgCl25mM， MnCl22. 5mM，EDTAO. 4mM，EGTAlmM，3 -丙三醇-磷酸盐 2. 5mM，二硫苏糖醇 0. 05mM，所述反 应缓冲液pH较佳地为7. 0。筛选RIP3蛋白激酶抑制剂时，在缓冲液中加入RIP3蛋白激酶、 髓銷喊性蛋白和待测RIP3蛋白酶抑制剂，之后加入ATP，从而制备反应溶液体系，该反应溶 液体系中ATP的浓度较佳地为10 y M，髓鞘碱性蛋白的浓度较佳地为30ng/ill，RIP3蛋白 激酶的浓度较佳地为5U/iU，25°C摇床反应75min后加入荧光素和荧光素酶并检测发光 值。发光值的检测方法为：利用各种市售荧光检测试剂盒检测，所述荧光检测试剂盒较佳地 为Promega公司的Kinase-Glo突光检测试剂盒，检测方法具体请参见该试剂盒的说明书内 容。
[0018] 特异性反应率的检测方法为：反应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与 未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相比较，特异性反应率=(空白组发光值-反应组发光 值）/空白组发光值X 100%。
[0019] 待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的计算方法较佳地为：将加入待测RIP3蛋白 激酶抑制剂的加药组特异性反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反 应率相比较，待测RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率％=(空白组特异性反应率-加药组特异性 反应率）/空白组特异性反应率X 100%。
[0020] 为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之三为：一种RIP3蛋白激酶活性的 检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
[0021] (1)配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6. 5?7. 0,在该反应缓冲液中加 入待测RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反 应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/iil?30ng/iil，ATP浓度为10iiM?20iiM，震 荡或静置条件下进行反应，反应温度为20°C?30°C，反应时间为60?90分钟；
[0022] (2)检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋 白激酶的活性。
[0023] 步骤（1)所述反应缓冲液的组分更佳地为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM?10mM， MgCl22. 5mM ?5mM，MnCl22. 5mM ?5mM，EDTAO. 4mM ?ImM，EGTAO. 4mM ?ImM，3 -丙三醇-磷 酸盐2. 5mM?5mM和二硫苏糖醇0. 02mM?0. ImM。
[0024] 其中步骤（2)所述检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度的方法为本领域 常规方法，较佳地为利用荧光信号检测ATP浓度。所述的方法较佳地包括以下步骤：向步骤 (1)所得反应体系溶液中加入荧光素和荧光素酶，检测发光信号。该检测方法可以利用各种 市售突光检测试剂盒检测，所述突光检测试剂盒较佳地为Promega公司的Kinase-Glo突光 检测试剂盒，具体步骤请参见该试剂盒的说明书。
[0025] 步骤（2)所述根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括以下步骤：反 应结束后将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组发光值相 比较，反映RIP3蛋白激酶活性的特异性反应率=(空白组发光值-反应组发光值)/空白组 发光值X 100%。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明提出的解决方案之四为：威罗菲尼或索拉菲尼在制 备RIP3蛋白激酶抑制剂中的用途。
[0027] 其中所述威罗菲尼（Vemurafenib)的制备方法为本领域常规方法，或者市售可得。
[0028] 其中所述索拉菲尼的化学名为：4_ {4- [3_(4-氯-3-三氟甲基-苯基)_酰脲]-苯 氧基}_吡啶-2-羧酸甲胺-4-甲苯磺酸盐。其分子式为：C21H16C1F3N403分子量为： 464. 8249496,所述索拉菲尼的制备方法为本领域常规方法，或者市售可得。
[0029] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0030] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031] 本发明的积极进步效果在于：本发明所述筛选RIP3蛋白激酶抑制剂的方法具有 无污染、安全性高、灵敏度高、通量高而且简便易操作的优点，本发明所述RIP3蛋白激酶活 性的检测方法具有特异性强，灵敏度高，信号检出率高的优点。
[0032] 与放射性同位素法相比，本发明所述筛选方法的优点在于：1.显而易见的无污染 性和高安全性。2.高通量，能够使用384孔微孔板筛选RIP3抑制剂，单人人工操作2h内 可实现300个化合物以上的筛选通量，而同等条件下放射性同位素法化合物筛选量少于60 个。
[0033] 利用本发明所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选方法和试剂盒，筛选出索拉菲尼和威 罗菲尼具有很强的RIP3蛋白激酶抑制活性，可以用于制备RIP3蛋白激酶抑制剂。

【专利附图】

【附图说明】
[0034] 图1为ATP消耗法反应原理示意图。
[0035] 图2为RIP3重组蛋白纯化的各组分SDS-PAGE检测结果示意图。其中泳道a为杆 状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液；b为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离 心所得上清；c为杆状病毒感染的Sf9细胞的全细胞裂解液离心所得沉淀；d、e、f?为清洗缓 冲液；g、h、i为溶解缓冲液;M为Marker。
[0036] 图3为RIP3重组蛋白特异性抗体检测结果示意图。其中泳道a和c为同一克隆 表达的RIP3蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果，泳道b和d为另一克隆表达的RIP3 蛋白激酶和GST融合蛋白的western结果。
[0037] 图4为不同用量的RIP3重组蛋白进行反应所测得发光值检测结果示意图。
[0038] 图5为不同浓度的ATP进行反应发光值检测结果示意图。
[0039] 图6为不同温度下进行反应发光值检测结果示意图。
[0040] 图7为不同时间检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。
[0041] 图8为不同pH值检测反应进行程度与特异性反应率检测结果示意图。
[0042] 图9为不同化合物对RIP3抑制作用的检测结果示意图。

【具体实施方式】
[0043] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0044] 主要实验材料和试剂：
[0045] 质粒
[0046] RIP3全长cDNA载体质粒为pGEM-T，购自北京义翘神州生物技术有限公司（货号 HG11267-G)。PfastBac-GST表达载体购自Invitrogen公司，该载体带有GST-Tag编码序 列，编码产物位于融合蛋白N端。
[0047] 菌种和细胞
[0048]大肠杆菌 DH5a、大肠杆菌 DHlOBac 以及 Spodoptera frugiperda9 (sf9)昆虫细胞 均购自Invitrogen公司；
[0049] DNA引物由Invitrogen公司合成；
[0050]髓鞘碱性蛋白（MBP 蛋白）、Bacmid 抽提试剂盒（PureLink?HiPure Plasmid DNA Minipr 印 Kit)，IPTG，Glutathione，Bluo-gal，以及转染试剂 CELLFECTIN? 购自 Invitrogen 公司；
[0051] DNA 聚合酶（K0D - Plus)购自 Toyobo 公司；
[0052] 质粒抽提试剂盒、琼脂糖凝胶电泳DNA片段回收试剂盒和PCR产物纯化试剂盒购 自QIAGEN公司；
[0053]限制性内切酶 Sal I-HF 及 Hind III 购自 New England Biolabs 公司；
[0054]连接酶 DNA Ligation Kit 购自 Takara 公司；
[0055]蛋白定量试剂盒 GST tag ELISA Detection Kit 购自 Genescript 公司；
[0056] TMN-FH培养基、酵母浸出膏（Yeast Extract)、胰蛋白胨（Tryptone)购自 Sigma-Aldrich 公司；
[0057] anti-RIP3 抗体购自 R&D 公司（货号 MAB76〇4);
[0058] anti-GST 抗体购自 Santa Cruz Biotech 公司；
[0059] Glutathione Sepharose4B 购自 GE Healthcare 公司；
[0060] Pierce ECL Western Blotting Substrate 试剂（购自 Thermo 公司）；
[0061] MOPS，MnCl2, MgCl2, EDTA，EGTA，0-glycerol-phosphate，DTT (二硫苏糖醇）等普 通分析纯化学试剂购自百灵威公司。
[0062] 主要实验仪器
[0063] 4°C高速离心机 Centrifuge5810R (Eppendorf 公司）；
[0064] PCR 反应仪 Mastercycler nexus XI (Eppendorf 公司）；
[0065]紫外凝胶成像系统 GelVue UV Transilluminator (Syngene 公司）；
[0066]蛋白垂直电泳装置 Mini-PR0TEAN3Cell (Bio-Rad 公司）；
[0067]微孔板（White 0paque384_well MicroPlate，PerkinElmer 公司）；
[0068]微孔板酶标仪 SpectraMax340PC384 (Molecular Device 公司）；
[0069] Envision 多标记微孔板检测仪（2104 EnVision漱 Multilabel Reader， PerkinElmer 公司）。
[0070] 实施例1RIP3重组蛋白的表达和检测以及RIP3蛋白激酶活性检测实验条件优化
[0071] 1、RIP3重组蛋白的表达和检测
[0072] 以PGEM-T-RIP3质粒为模板，扩增RIP3的cDNA全长片段，使用引物序列如下：
[0073]正向引物：5y-TACGTCGACTATGTCGTGCGTCAAGTTATG-3'(下划线部分为 Sal I-HF 酶 切位点），其序列如序列表中SEQ ID N0 :1所示；
[0074] 反向引物:5' -GACAAGCTTTTATTTCCCGCTATGATTATACC-3'(下划线部分为 Hind III 酶切位点），其序列如序列表中SEQ ID NO :2所示。
[0075] 用KOD-Plus多聚酶进行PCR反应；
[0076] PCR 反应体系为（50ii 1) :10XK0D-Plus-缓冲液 l，2mM dNTP 加 l，25mM 1%504加2111，1011]?正向引物1.5111，1011]\1反向引物1.5111，质粒模板501^，1(00-?1118 DNA 聚合酶 1 ii 1，ddH20 加 38 ii 1。
[0077] PCR反应程序为：
[0078] (1) 94°C，2min (2) 94°C，15sec，（3) 6(TC，30sec，（4) 68°C，1. 5min，步骤（2)? (4)重复30个循环，（3)72°C，5min。反应产物经过纯化后用内切酶Sal I-HF和Hind III 进行双酶切，37 °C反应2h，反应体系为：
[0079]

【权利要求】
1. 一种RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤： (1) 配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6. 5?7. 0,在该反应缓冲液中加入 RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，待测RIP3蛋白激酶抑制剂，之后加入ATP，从而配制成 反应体系溶液，该反应体系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/iil?30ng/iil，RIP3蛋白 激酶浓度为5U/iil，ATP浓度为10 iiM?20 iiM，震荡或静置条件下进行反应，反应温度为 20°C?30°C，反应时间为60?90分钟； (2) 检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激 酶抑制剂的抑制率。
2. 如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1)所述反 应缓冲液的组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM?10mM，MgCl22. 5mM?5mM，MnCl22. 5mM? 5mM，EDTAO. 4mM?ImM，EGTAO. 4mM?ImM，P -丙三醇-磷酸盐2. 5mM?5mM和二硫苏糖醇 0. 02mM ?0. ImM。
3. 如权利要求1所述RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（2)所述根 据ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶抑制剂的抑制率的方法包括以下步骤：反应结束后加入荧 光素和荧光素酶并检测特异性反应率，将加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的加药组特异性 反应率与未加入待测RIP3蛋白激酶抑制剂的空白组特异性反应率相比较，待测RIP3蛋白 激酶抑制剂的抑制率％=(空白组特异性反应率_加药组特异性反应率）/空白组特异性反 应率X 100%。
4. 如权利要求1所述的RIP3蛋白激酶抑制剂的筛选方法，其特征在于，步骤（1)所述 反应缓冲液的pH值为7. 0,反应温度为25°C，震荡的速度为50?100RPM，反应时间为75分 钟。
5. -种RIP3蛋白激酶抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括RIP3蛋白激 酶、髓鞘碱性蛋白、反应缓冲液、荧光素和荧光素酶。
6. 如权利要求5所述RIP3蛋白激酶抑制剂筛选试剂盒，其特征在于，其中所述反应缓 冲液组分为：3-(N-吗啉基)丙磺酸 10mM，MgCl25mM，MnCl22. 5mM，EDTA0. 4mM，EGTAlmM，3 -丙 三醇-磷酸盐2. 5mM，二硫苏糖醇0. 05mM，所述反应缓冲液pH值为7. 0。
7. -种RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤： (1) 配制反应缓冲液，所得反应缓冲液的pH值为6. 5?7. 0,在该反应缓冲液中加入待 测RIP3蛋白激酶和/或髓鞘碱性蛋白，之后加入ATP，从而配制成反应体系溶液，该反应体 系溶液中髓鞘碱性蛋白浓度为15ng/ ill?30ng/ iil，ATP浓度为10 y M?20 y M，震荡或 静置条件下进行反应，反应温度为20°C?30°C，反应时间为60?90分钟； (2) 检测步骤（1)所得反应体系溶液中ATP的浓度，根据ATP的浓度计算RIP3蛋白激 酶的活性。
8. 如权利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤（1)所述反 应缓冲液的组分为：3-(N-吗啉基）丙磺酸5mM?10mM，MgCl22. 5mM?5mM，MnCl22. 5mM? 5mM，EDTAO. 4mM?ImM，EGTAO. 4mM?ImM，P -丙三醇-磷酸盐2. 5mM?5mM和二硫苏糖醇 0. 02mM ?0. ImM。
9. 如权利要求7所述RIP3蛋白激酶活性的检测方法，其特征在于，步骤（2)所述根据 ATP的浓度计算RIP3蛋白激酶的活性的方法包括以下步骤：反应结束后加入荧光素和荧光 素酶并检测发光值，将加入髓鞘碱性蛋白的反应组发光值与未加入髓鞘碱性蛋白的空白组 发光值相比较，RIP3蛋白激酶活性的特异性反应率=(空白组发光值-反应组发光值）/空 白组发光值XI00%。
10.威罗菲尼或索拉菲尼在制备RIP3蛋白激酶抑制剂中的用途。
【文档编号】C12Q1/66GK104450867SQ201310430041
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月18日 优先权日:2013年9月18日
【发明者】魏世英, 匡海门, 其他发明人请求不公开姓名 申请人:匡海门