一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法及检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法，将底物α-乙酸萘酯和底物β-乙酸萘酯按1∶1等体积混合作为混合底物，制备吸附混合底物的滤纸；采集蚜虫田间种群，匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，滤纸显色越深，个体酶活性越高。本发明所述方法能够通过检测个体非特异性酯酶（NSE）活性来判断田间种群的抗性水平。通过吸附混合底物的滤纸上个体显色颜色的深浅，与标准色板比较，从而得到抗性个体频率，进而了解种群抗性水平。
【专利说明】一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法及检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业害虫对有机磷抗药性的快速生化检测方法及混合底物检测试剂
盒
【背景技术】
[0002]昆虫抗药性的形成和发展给化学防治造成了很大困难，如何快速、准确的检测蚜虫抗药性水平是非常重要的。在昆虫抗药性检测方面目前主要是使用生物测定法和酶活性分析法，前者使用虫量大，操作复杂，不易掌握；后者对操作条件要求高，而且需要一定的仪器设备等条件，不适合在基层和田间推广使用。
[0003]目前蚜虫对有机磷的抗性检测主要是通过传统的生物测定一叶片药膜法进行:取新鲜无污染的甘蓝叶片浸在系列浓度的有机磷类药液中15秒，以蒸馏水(含
0.05%Triton-X100)作对照，室内晾干后接大小一致的无翅成蚜20头，每个浓度3次重复，24小时后检查结果。然后用POLO或SAS软件处理数据，计算LC5tl值，根据LC5tl值的比较来判断蚜虫对有机磷类药剂的抗性水平。
[0004]有机磷杀虫药剂作用于昆虫非特异性酯酶，昆虫非特异性酯酶活性越高，表明对药剂抗性越高。非特异性酯酶活性越高，分解其底物a-乙酸萘酯和3-乙酸萘酯能力越强，分解产物与显色剂结合显色就越深。因此显色越深的个体，表明其对有机磷药剂抗性越强。1981年Nicole Pasteur和George P.使用滤纸法测定蚊虫对有机磷的抗性(NicolePasteur, George P.1981.Mosquito News:Filter paper test for rapid determinationof phenotypes with high esterase activity in organophosphate resistantmosquitoes[J])。
【发明内容】
[0005]为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种检测与有机磷类杀虫剂抗性相关的蚜虫非特异性酯酶活性的方法及检测试剂盒。
[0006]为了实现本发明目的，本发明首先提供一种检测蚜虫非特异性酯酶(NSE)活性的方法，其是将底物a -乙酸萘酯(a -NA)和底物P -乙酸萘酯(P -NA)按1:1等体积混合作为混合底物，制备吸附混合底物的滤纸；采集蚜虫田间种群，匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，滤纸显色越深，个体酶活性越高。
[0007]进一步地，所述方法具体包括以下步骤:
[0008](I)配制底物:用丙酮配制质量浓度(w/v)为1%的a -乙酸萘酯和质量浓度(w/v)为1%的P -乙酸萘酯，4°C冰箱保存；
[0009](2 )将步骤(1)配制的底物按1:1等体积混合，将滤纸浸入其中，2min后，室温阴干;
[0010](3)用pH7.0的磷酸缓冲液配制0.15%的固蓝B盐作为匀浆液，匀浆单头蚜虫，取1/20体积的匀浆液滴到步骤(2)中制备的滤纸上，室温避光放置15min ；[0011](4)待显色完全后，统计步骤(3)中的个体显色颜色，与标准色板对比，滤纸显色越深，个体酶活性越高。
[0012]其中，步骤(3)中pH7.0的磷酸缓冲液，是由磷酸二氢钾(KH2P04)和十二水合磷酸氢二钠(Na2HPO4 ? 12H20)配制，浓度为 0.04M。
[0013]本发明还提供了一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的检测试剂盒，该试剂盒包括:
[0014]( I)吸附有混合底物的滤纸:
[0015]将丙酮配制的质量浓度为1%的a -乙酸萘酯和质量浓度为1%的P -乙酸萘酯等体积混合，吸附于定性滤纸上，阴干，锡箔纸包裹于4°C保存；
[0016](2)显色剂缓冲液:以0.04M、pH7.0的磷酸缓冲液配制0.15%的显色剂固蓝B，该显色剂须现配现用。
[0017]本发明还提供了利用前述检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法，检测蚜虫种群抗性个体频率的方法。
[0018]具体为，采集蚜虫田间种群，按照前述方法匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，统计个体显色颜色，每一种群重复检测100头以上，计算种群抗性个体频率；
[0019]所述抗性为有机磷抗性。
[0020]本发明的有益效果在于:
[0021 ] 本发明以a -乙酸萘酯(a -NA)和@ -乙酸萘酯(P -NA)混合底物对蚜虫田间种群的非特异性酯酶的生物化学性质进行了测定，结果发现各测试种群抗性个体频率与生物测定数据存在明显相关性。
[0022]因此，本发明所述方法能够通过检测个体非特异性酯酶(NSE)活性来判断田间种群的抗性水平。通过吸附混合底物的滤纸上个体显色颜色的深浅，与标准色板比较，从而得到抗性个体频率，进而了解种群抗性水平。
[0023]本发明方法适合应用于田间测定蚜虫种群抗性酯酶个体的频率分布，明确田间蚜虫种群抗性频率，从而及早掌握蚜虫种群抗性发展动态，为合理使用农药、制定治理抗性方案提供依据。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为本发明所述检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法流程图。
[0025]图2为比色标准色板。
[0026]图3为本发明实施例1中蚜虫非特异性酯酶在滤纸上的显色情况。
[0027]图4为不同底物蚜虫非特异性酯酶在滤纸上的显色情况。
【具体实施方式】
[0028]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0029]实施例1
[0030]1、研究对象
[0031 ] 本发明研究对象为全国各地采集的田间样本，室内饲养蚜虫种群。
[0032]2、方法[0033]用混合底物滤纸显色的方法，检测蚜虫田间种群非特异性酯酶活性，根据显色颜色深浅，与标准色板对比统计结果，具体流程参见附图1。
[0034]2.1蚜虫样本的采集及处理
[0035]采集无翅成蚜于离心管中，液氮速冻后保存到_80°C冰箱中。
[0036]2.2滤纸底物的制备
[0037]用丙酮制备1%的(w/v)的a-NA和P-NA,各称取Ig a-NA和P_NA用丙酮定容至100ml，保存于4°C冰箱中，使用前取等体积的二者混合，滤纸浸入其中计时2min，取出后阴干。
[0038]2.3缓冲液显色剂的制备
[0039]0.04M、pH7.0 的磷酸缓冲液(PBS)的配制，称取 8.75gNa2HP04 ? Iffi2O 和 2.12gKH2PO4,用蒸懼水定容至1L。
[0040]用上述配制的缓冲液配制0.15%固蓝B盐，称取0.03g固蓝B盐溶解到20ml的PBS中，作为匀浆液、显色剂，注意此匀浆液需现配现用。用该匀浆液匀浆单头蚜虫，取1/20体积的匀浆液滴到上述制备的滤纸上，室温避光放置15min，被测种群须检测100头以上。
[0041]2.4滤纸法非特异性酯酶活性测定结果统计计算
[0042]有机磷杀虫药剂作用于昆虫非特异性酯酶，昆虫非特异性酯酶活性越高，表明对药剂抗性越高。非特异性酯酶活性越高，分解其底物a-乙酸萘酯和3-乙酸萘酯能力越强，分解产物与显色剂结合显色就越深。因此显色越深的个体，表明其对有机磷药剂抗性越强。
[0043]根据标准色板(如图2所示)，对比显色与2号颜色相同或比2号颜色深的个体为低敏感个体即抗性个体；显色与4号颜色相同或比4号颜色浅的个体为高敏感个体；处于2号与4号之间的为中度敏感个体。对比区分个体敏感度情况(如图3所示)，每一种群重复检测100头以上，计算种群抗性个体频率。
[0044]抗性个体频率=抗性个体数/供试虫总数
[0045]实施例2
[0046]1、研究对象
[0047]研究对象为全国各地采集的田间样本，室内饲养蚜虫种群。
[0048]2、方法
[0049]采用单一底物，a -NA或P -NA,匀浆液采用普通的磷酸缓冲液。
[0050]2.1蚜虫样本的采集及处理
[0051]采集无翅成蚜于离心管中，液氮速冻后保存到_80°C冰箱中。
[0052]2.2底物的制备
[0053]用丙酮制备1%的(w/v)的a -NA或@ -NA,保存于4°C冰箱中。
[0054]2.3显色剂的制备
[0055]用蒸馏水配制0.15%固蓝B盐，作为显色剂，注意此匀浆液需现配现用。取1/20体积的匀浆液滴到上述制备的滤纸上，室温避光放置15min，被测种群须检测100头以上。
[0056]2.4缓冲液的制备
[0057]0.04M、pH7.0 的磷酸缓冲液(PBS)的配制，称取 8.75gNa2HP04 ? Iffi2O 和 2.12gKH2PO4,用蒸懼水定容至1L。[0058]2.5用2.4中制备的PBS匀浆2.1准备好的单头蚜虫，取1/20匀浆液点样至定性滤纸上，将点过样的滤纸浸入2.2制备的底物中2min，取出用薄纸吸除滤纸上多余的水分，再将滤纸浸入2.3制备的显色剂中4min，取出后将滤纸条过蒸馏水，之后在10%的冰醋酸中固定数分钟，置于黑暗中晾干。
[0059]显色情况见图4，从图4可以明显看出，由左至右底物依次为:a -NA、^ -NA、a -NA与@ -NA等体积混合底物。从实施例1和实施例2的具体操作步骤中可以明显看到，单独用a -NA、^ -NA做底物，显色颜色较浅，而混合底物较单一底物来说，由于对不同羧酸酯酶同工酶更有针对性，可满足不同同工酶的水解要求，体现在最终的反应颜色上，显色颜色更深、更充分，因此更容易将不同抗性水平的种群区分开。另外，本发明还将匀浆液改为缓冲液显色剂，大大简化了操作步骤。
[0060]实施例3试剂盒的制备及应用
[0061]1.吸附有混合底物的滤纸:
[0062]将丙酮配制的质量浓度为1%的a -乙酸萘酯和质量浓度为1%的0 -乙酸萘酯等体积混合，吸附于定性滤纸上，阴干，锡箔纸包裹于4°C保存；
[0063]2.显色剂缓冲液:以0.04M、pH7.0的磷酸缓冲液配制0.15%的显色剂固蓝B，此显色剂须现配现用。
[0064]具体应用同实施例1:采集蚜虫田间种群，按照前述方法匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，统计抗性个体显色颜色，每一种群重复检测100头以上，计算种群抗性个体频率，了解供试种群抗性水平。
[0065]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【权利要求】
1.一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的方法，其特征在于，将底物a-乙酸萘酯和底物β-乙酸萘酯按1:1等体积混合作为混合底物，制备吸附混合底物的滤纸；采集蚜虫田间种群，匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，滤纸显色越深，个体酶活性越高。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其具体包括以下步骤: (1)配制底物:用丙酮配制质量浓度为1%的a-乙酸萘酯和质量浓度为1%的P -乙酸萘酯，4°C冰箱保存； (2)将步骤(1)配制的底物按1:1等体积混合，将滤纸浸入其中，2min后，室温阴干； (3)用pH7.0的磷酸缓冲液配制0.15%的固蓝B盐作为匀浆液，匀浆单头蚜虫，取1/20体积的匀浆液滴到步骤(2)中制备的滤纸上，室温避光放置15min ； (4)待显色完全后，统计步骤(3)中的个体显色颜色，与标准色板对比，滤纸显色越深，个体酶活性越高。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中pH7.0的磷酸缓冲液，由磷酸二氢钾和十二水合磷酸氢二钠配制，浓度为0.04M。
4.一种检测蚜虫非特异性酯酶活性的检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括: (1)吸附有混合底物的滤纸: 将丙酮配制的质量浓度为1%的a -乙酸萘酯和质量浓度为1%的P -乙酸萘酯等体积混合，吸附于定性滤纸上，阴干，锡箔纸包裹于4 V保存； (2)显色剂缓冲液:以0.04M、pH7.0的磷酸缓冲液配制0.15%的显色剂固蓝B。
5.利用权利要求1-3任一项所述方法，检测蚜虫种群抗性个体频率的方法，其特征在于，采集蚜虫田间种群，匀浆单头蚜虫后，将匀浆液滴到滤纸上显色，与标准色板对比，统计个体显色颜色，每一种群重复检测100头以上，计算种群抗性个体频率；所述抗性为有机磷抗性。
【文档编号】C12Q1/44GK103497990SQ201310476436
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2013年10月12日 优先权日:2013年10月12日
【发明者】高希武, 刘晓岚, 汤秋玲, 李永丹, 梁沛 申请人:中国农业大学