具有降低的非特异性活性的Sso7-聚合酶缀合物的制作方法
【专利摘要】提供了改进的Sso7-聚合酶缀合蛋白。本发明提供Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶连接的Sso7结构域；其中：所述Sso7结构域的与SEQ?ID?NO：2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)；和／或所述Sso7结构域的与SEQ?ID?NO：2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)，其中所述缀合蛋白与在其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中，所述Sso7结构域的与SEQ?ID?NO：2的K28对应的氨基酸是赖氨酸(K)，且所述Sso7结构域的与SEQ?ID?NO：2的R43对应的氨基酸是精氨酸(R)。
【专利说明】具有降低的非特异性活性的SS07-聚合酶缀合物
[0001]对相关专利申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年4月8日提交的美国临时专利申请号61 / 473，682和2011年6月22日提交的美国临时专利申请号61 / 499，873的优先权权益，它们各自通过引用并入。
【背景技术】
[0003]核酸扩增反应，诸如聚合酶链反应(PCR)，一般是模板依赖性反应，其中所需的核酸序列通过使用过量的两种寡核苷酸引物处理靶核酸的分离的互补链来扩增。所述引物延伸形成互补引物延伸产物，所述产物起模板作用，以用于合成所需的核酸序列。在这样的过程中，选择性扩增各DNA链上的引物之间的核酸序列。
[0004]通过将非序列特异性的双链核酸结合结构域连接至酶或它的催化域，可以提高聚合酶的活性(参见，例如，W00192501)。这样的经修饰的聚合酶表现出与未修饰的酶相比增加的持续合成能力。
【发明内容】
[0005]本发明提供了 Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶连接的Sso7结构域；其中:
[0006]所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸⑷；和/或
[0007]所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)，
[0008]其中所述缀合蛋白与在其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中`，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸是赖氨酸(K)，且所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸是精氨酸(R)。
[0009]在一些实施方案中，与对照缀合蛋白的非特异性扩增活性相比，所述Sso7聚合酶缀合蛋白的非特异性扩增活性降低至少10%。
[0010]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丝氨酸⑶、苏氨酸⑴、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸⑶、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
[0011]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。
[0012]在一些实施方案中，所述聚合酶基本上没有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0013]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的前58或60个氨基酸或与SEQ ID NO:2的全长基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0014]在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
[0015]在一些实施方案中，所述聚合酶结构域具有热稳定的聚合酶活性。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是Δ Taq聚合酶结构域。
[0016]在一些实施方案中，所述聚合酶结构域是家族B聚合酶结构域。在一些实施方案中，所述聚合酶结构域得自热球菌属(Pyrococcus)。
[0017]本发明也提供了反应混合物，其包含如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含至少一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸(dNTP)、盐、DNA结合染料或稳定剂。
[0018]本发明也提供了试剂盒，其包含如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步在含有所述缀合蛋白的相同或不同的容器中包含下述的至少一种:一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸(dNTP)、盐或稳定剂。
[0019]在一些实施方案中，所述组合物包含当在20°C至37°C之间时具有不超过0.027pH单位/ 0C的变化的缓冲液(当在0.1M浓度测量时)。在一些实施方案中，所述缓冲液选自由以下各项组成的组:HEPES、ACES、PIPES、MOPSO, BES, MOPS、TES, TAPSO, P0PS0、BICINE、TAPS 和 AMPSO。
[0020]本发明也提供了扩增样品中的靶核酸的方法。在一些实施方案中，所述方法包括，在允许用引物扩增靶核酸的条件下，在反应混合物中温育所述靶核酸，所述反应混合物包含:`
[0021]a.至少一种引物；和
[0022]b.如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，
[0023]由此扩增所述靶核酸。
[0024]在一些实施方案中，所述方法包括聚合酶链反应(PCR)。
[0025]本发明也提供了核酸，其包含编码如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(U、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸⑴。
[0026]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。[0027]在一些实施方案中，所述聚合酶基本上没有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0028]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的前58或60个氨基酸或与SEQ ID NO:2的全长基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0029]在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
[0030]本发明也提供了包含重组表达盒的细胞，所述表达盒包含与编码如上面或本文别处所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丝氨酸
(S)、苏氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸(Y)。
[0031]在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸(P)。
[0032]在一些实施方案中，所述聚合酶基本上没有3’ -5’外切核酸酶活性。
[0033]在一些实施方案中，所`述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的前58或60个氨基酸或与SEQ ID NO:2的全长基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2至少90%相同。
[0034]在一些实施方案中，所述聚合酶与SEQ ID N0:33或SEQ ID N0:34或SEQ ID NO:61基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。在一些实施方案中，所述聚合酶包含SEQ ID NO:33 或 SEQ ID NO:34 或 SEQ ID NO:61。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1.不同的Sso7氨基酸序列(分别是SEQ ID NO:2、3、6、4和5)的比对。
[0036]定义
[0037]除非另外定义，本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域中一般技术人员通常理解的相同含义。一般地，本文中使用的术语和下述的细胞培养实验室程序、分子遗传学、有机化学、和核酸活性和杂交是本领域中公知并普遍使用的那些。使用标准技术来进行核酸和肽分析。所述技术和程序通常按照本领域中常规方法和多种一般参考文件(一般参见，Sambrook 等 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL (分子克隆:实验室手册)，第二版(1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press (冷泉港实验室出版社)，ColdSpring Harbor (冷泉港)，N.Y.,其通过引用并入本文)来进行，其在本文全文中提供。本文中使用的术语和下述分析化学、和有机合成的实验室程序是本领域中公知和普通使用的那些。[0038]术语“Sso7”或“Sso7DNA结合结构域”或“Sso7_样DNA结合结构域”或“Sso7结构域”表示这样的核酸和多肽多形变体、等位基因、突变体、种间同源物:(1)其氨基酸序列与SEQ ID NO:2具有大于约60%氨基酸序列同一性、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%或更大的氨基酸序列同一性；(2)其在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1的Sso7d核酸序列及其保守修饰的变体特异性地杂交；或⑶其核酸序列与SEQ ID NO:1具有大于约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
或更高的核苷酸序列同一性。该术语包括全长Sso7d多肽和所述多肽的具有序列非特异性双链结合活性的片段。Sso7_样蛋白包括、但不限于:Sso7d、Sac7d和Sac7e。
[0039]“结构域”表示蛋白或蛋白复合物的单元，其包括多肽序列、完整多肽序列、或许多多肽序列，其中所述单元具有定义的功能。理解所述功能是广泛定义的，且可以是配体结合、催化活性或可以对蛋白的结构具有稳定作用。
[0040]关于蛋白的部分使用的“异源的”表示所述蛋白包括两个或多个在自然界彼此间不以相同关系存在的结构域。这样的蛋白，例如，融合蛋白，含有两个或多个来自被安排形成新的功能性蛋白的无关蛋白的结构域。
[0041]“连接”表示本领域中关于功能性连接蛋白结构域的任何已知方法，包括但不限于具有或不具有干扰结构域的重组融合、内含肽-介导的融合、非共价连接、和共价键结合、包括二硫键结合；氢键结合；静电结合；和构象结合，例如，抗体-抗原，和生物素-抗生物素蛋白连接。
[0042]本文中使用的“热稳定的聚合酶”表示利用DNA或RNA作为模板，通过将核苷酸单元加入至核苷酸链来催化多核苷酸合成的任何酶，并在高于45°C的温度下具有最佳活性。
[0043]“栖热菌属(Thermus)聚合酶”指由任何栖热菌属物种分离的家族ADNA聚合酶，包括但不限于水生栖热菌(Thermus` aquaticus)、Thermus brockianus、和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus);源自栖热菌属物种的任何重组聚合酶,及其任意功能性衍生物，无论是通过遗传修饰或化学修饰或本领域中已知的其它方法来衍生。
[0044]术语“扩增反应”表示用于增加核酸靶序列拷贝的任意体外方法。这样的方法包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、DNA连接酶链反应(参见美国专利号4，683，195和
4,683, 202 ；PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR 流程:方法和应用指导)(Innis等编，1990))，(LCR)、QBeta RNA复制酶、和基于RNA转录的(诸如TAS和3SR)的扩增反应以及本领域技术人员已知的其它方法。
[0045]“扩增”表示使溶液经历足以容许扩增多核苷酸的条件的步骤，条件是反应的全部组分是完整的。扩增反应的组分包括，例如，引物，多核苷酸模板、聚合酶、核苷酸等。术语“扩增”典型地表示靶核酸的“指数”增加。然而，本文中使用的“扩增”还可以表示核酸的选择靶序列数量的线性增加，诸如使用循环测序获得的。
[0046]术语“扩增反应混合物”表示包含用于扩增靶核酸的多种试剂的水溶液。这些包括酶、水性缓冲液、盐、扩增引物、靶核酸、和核苷三磷酸。如本文中进一步讨论地，扩增反应混合物还可以进一步包括稳定剂和其它用于最优化效率和特异性的添加剂。根据上下文，所述混合物可以是完全的或不完全的扩增反应混合物。
[0047]“聚合酶链反应”或“PCR”表示这样的方法，通过该方法以几何级数扩增靶双链DNA的特定区段或子序列。PCR是本领域技术人员公知的技术；参见，例如，美国专利号4,683，195 和 4，683，202 jPIPCR Protocols:A Guide to Methods and Applications (PCR流程:方法和应用指导)，Innis等编，1990。示范性PCR反应条件典型地包括两步骤或三步骤循环。两步骤循环具有变性步骤，随后是杂交/延伸步骤。三步骤循环包括变性步骤，随后是杂交步骤，随后是单独的延伸步骤。
[0048]关于核酸扩增使用的术语“特异性”表示，与非特异性扩增产物相比，产生特异性扩增产物的核酸扩增反应的可能性。“特异性扩增产物”表示，通过用正确配对的引物和模板(即，正确靶序列)的扩增产生的多核苷酸。“非特异性扩增产物”表示，通过用错配的引物和模板的扩增产生的多核苷酸。 [0049]关于核酸扩增使用的短语“提高特异性”或“改善特异性”表示，与产生的非特异性扩增产物的量相比，在核酸扩增中产生的特异性扩增产物的量的可检测的增加。扩增反应的特异性可以根据任意方法来测量，包括、但不限于解链曲线分析或凝胶分析。在一些实施方案中，如下确定核酸扩增反应的特异性:对比两种产物的相对产率，其中一种产物是具有预期的Tm的特异性产物，且另一种产物是非特异性产物，其具有比特异性产物的Tm更低或更高的Tm。与具有含野生型Sso7结构域的对照聚合酶的反应混合物中的特异性产物相对于非特异性产物的相对产率相比，包含Sso7-聚合酶缀合物(其具有如本文中所述的含K28和/或R43突变的Sso7结构域)的反应混合物将在扩增反应中具有更高的特异性产物相对于非特异性产物的相对产率(即，通过特异性产物的解链峰的高度与非特异性产物的解链峰的高度之比测得的产率之比)。在一些实施方案中，与其中对照聚合酶具有野生型Sso7结构域的反应相比，具有如本文中所述的含K28和/或R43突变的Sso7结构域的Sso7-聚合酶缀合物将具有所述比率增加至少10 %、15 %、20 %、25 %、30 %、40 %、50 %、100%,2倍(200% )、2.5倍(250% )、3倍(300% )或更大的提高的扩增特异性。
[0050]“引物”表示与靶核酸上的序列杂交并担当核酸合成的起始点的多核苷酸序列。引物可以具有不同的长度，且通常长度小于50个核苷酸，例如，长度为12-30个核苷酸。用于PCR中的引物的长度和序列可以基于本领域技术人员已知的原则来设计，参见，例如，Inni s等,见上文。
[0051]“模板”表示这样的多核苷酸序列，其包括侧连引物杂交位点的待扩增的多核苷酸。因此，“靶模板”包括侧连关于5’弓丨物和3’引物的杂交位点的靶多核苷酸序列。
[0052]本文中使用的“核酸”表示DNA、RNA、单链、双链或更加高度聚集的杂交基序，及其任意化学修饰。修饰包括，但不限于，向核酸配体碱基或向作为整体的核酸配体提供结合另外的电荷、极性、氢键结合、静电相互作用、连接点和功能性的化学基团的那些。这样的修饰包括，但不限于，肽核酸(PNAs)，磷酸二酯基修饰，(例如，硫代磷酸酯，甲基膦酸酯)，2 ^ -位糖修饰，5-位嘧啶修饰，8-位嘌呤修饰，环外胺的修饰，4-硫尿苷的置换，5-溴-尿嘧啶或5-碘-尿嘧啶的置换；主链修饰，甲基化，不寻常碱基配对组合诸如异碱基(isobase),异胞苷(isocytidine)和异胍(isoguanidine)等。核酸还可以包括非天然碱基，诸如，例如，硝基吲哚。修饰还可以包括3'和5'修饰诸如用荧光团(例如，量子点)或另一种结构部分加帽。
[0053]术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用，表示氨基酸残基的聚合物。该术语应用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。
[0054]术语“氨基酸”表示天然存在和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及稍后修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸，Y-羧基谷氨酸，和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物表示与天然存在的氨基酸具有相同基础化学结构(即，与氢原子、羧基、氨基、和R基结合的α碳原子)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基(例如，正亮氨酸)或修饰肽主链，但是保持与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构。氨基酸模拟物表示具有与氨基酸的一般化学结构不同的结构但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化学化合物。
[0055]氨基酸在本文中可以通过其普遍已知的三字母符号或通过由IUPAC-1UB生物化学命名委员会推荐的一字母符号来提及。同样地，核苷酸可以通过其普遍接受的单字母密码来提及。
[0056]“保守修饰变体”应用于氨基酸和核酸序列二者。关于特定的核酸序列，保守修饰变体表示编码相同或基本相同氨基酸序列，或其中核酸不编码氨基酸序列的那些核酸，基本相同序列。由于遗传密码的简并，大量功能相同的核酸编码任何给定蛋白。例如，密码子GCA,GCC,GCG和G⑶都编码氨基酸丙氨酸。因此，在通过密码子指定丙氨酸的各个位置处，该密码子可以改变为所述相应密码子中任一个，而不改变编码的多肽。这样的核酸变化是“沉默变化”，其是保守修饰变化的一种。本文中编码多肽的各核酸序列也描述各种可能的核酸的沉默变化。本领域技术人员应该认识到，核酸中的各密码子(除AUG(其通常仅编码甲硫氨酸)和TGG(其通常仅编码色氨酸外)可以修饰为产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变化是各所述序列中固有的。
[0057]关于氨基酸序列，本领域技术人员应该认识到，在编码的序列中改变、添加或缺失单氨基酸或小比例氨基酸的各置换、缺失或添加核酸、肽、多肽、或蛋白序列是“保守修饰的变体”，其中变化导致氨基酸被化学类似的氨基酸置换。提供功能相似氨基酸的保守置换表是本领域中公知的。这样的保守修`饰变体是本发明多形变体、种间同源物、和等位基因以外的，但不排除这些。
[0058]术语“编码”表示编码一个或多个氨基酸的多核苷酸序列。该术语不需要起始密码子或终止密码子。氨基酸序列可以以由多核苷酸序列提供的6种不同阅读框中任一种来编码。
[0059]术语“启动子”表示位于转录起始上游和/或下游并参与识别和结合RNA聚合酶和其它蛋白以起始转录的区域或序列。
[0060]“载体”表示这样的多核苷酸，其在独立于宿主染色体时，能够在宿主生物体中复制。优选的载体包括质粒，且典型地具有复制起点。载体可以包括，例如，转录和翻译终止子，转录和翻译起始序列，和有效用于调节特定核酸表达的启动子。
[0061]“重组体”表示人操作的多核苷酸或人操作的多核苷酸的拷贝或补体。例如，包括与第二多核苷酸可操作连接的启动子的重组表达盒可以包括与所述第二多核苷酸异源的启动子，这是人操作(例如，通过Sambrook等，Molecular Cloning-A LaboratoryManual (分子克隆:实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory (冷泉港实验室)，ColdSpring Harbor (冷泉港)，Ν.Υ.，(1989)或Current Protocols in Molecular Biology (当前分子生物学方案)第1-3卷，John Wiley & Sons, Inc.(1994-1998)所述的方法)包含表达盒的分离的核酸的结果。在另一个实例中，重组表达盒可以包括以这样的方式组合的多核苷酸，所述方式使得所述多核苷酸极不可能在自然界中找到。例如，人操作的限制位点或质粒载体序列可以使启动子侧连所述第二多核苷酸或使启动子与所述第二多核苷酸分开。本领域技术人员应该认识到，多核苷酸可以以许多方式来操作并不限于以上实例。
[0062]“聚合酶”表示进行多核苷酸(例如，DNA和/或RNA)的模板指导的合成的酶。该术语包括具有聚合酶活性的全长多肽和结构域。DNA聚合酶是本领域技术人员公知的，包括但不限于，由激烈热球菌(Pyrococcus furiosus), Thermococcus Iitoralis,和海栖热袍菌(Thermotoga maritime),或其修饰形式分离或来源的DNA聚合酶。它们包括DNA-依赖性聚合物和RNA-依赖性聚合酶(诸如逆转录酶)二者。已知至少5个DNA-依赖性DNA聚合酶家族，尽管大部分属于家族A、B和C。不同家族之间存在很少或不存在序列相似性。大多数家族A聚合酶是单链蛋白，其可以含有多酶功能包括聚合酶、3'至5'外切核酸酶活性和5'至3'外切核酸酶活性。家族B聚合酶典型地具有聚合酶的单催化结构域和3'至5'外切核酸酶活性，以及辅助因子。家族C聚合酶典型地是多亚单元蛋白，其具有聚合和3'至5'外切核酸酶活性活性。在大肠杆菌(E.coli)中，已经发现三种类型的DNA聚合酶，即DNA聚合酶I (家族A)、II (家族B)和III (家族C)。在真核细胞中，三种不同的家族B聚合酶，即DNA聚合酶α、δ和ε，参与核复制，且家族A聚合酶，即聚合酶Y，用于线粒体DNA复制。其它类型的DNA聚合酶包括噬菌体聚合酶。类似地，RNA聚合酶典型地包括真核RNA聚合酶1、II和III，和细菌RNA聚合酶以及噬菌体和病毒聚合酶。RNA聚合酶可以是DNA-依赖性和RNA-依赖性的。
[0063]两个核酸序列或多肽被称为“相同”，如果这两个序列中的核苷酸或氨基酸残基序列在如下所述比对以获得最大对应性时，分别相同。术语“相同”或百分比“同一性”在两个或多个核酸或多肽序列的背景下，表示当比较和比对以在比较窗中获得最大对应性时，相同或具有特定百分比的相同的氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，其如使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察来测量。当序列同一性的百分比关于蛋白或多肽使用时，认为不相同的残基位置通常由于保守氨基酸置换而不同，其中氨基酸残基被置换为具有类似化学特性(例`如，电荷或疏水性)的其它氨基酸残基并因此不改变该分子的功能特性。当序列在保守置换中不同时，百分比序列同一性可以上调，以校正置换的保守天性。用于进行该调整的手段是本领域技术人员公知的。典型地，这涉及将保守置换作为部分而非完全错配来评分，由此增加百分比序列同一性。因此，例如，当相同的氨基酸给分为I且非保守置换给分为O时，保守置换给分在O和I之间。保守置换的评分根据例如，Meyers & Miller 的算法，Computer Applic.Biol.Sc1.(计算机应用生物科学)4:11-17 (1988)来计算，例如，如以程序 PC / GENE (Intelligenetics, Mountain View,加利福尼亚，USA)进打。
[0064]在下述情况下，序列是彼此“基本上相同的”:当比较和比对以在比较窗或特定区域中获得最大对应性时，它们具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在特定区域内至少 60%,65%,70%,75%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97 %、98 %或99 %同一性)，其中使用一种以下序列比较算法或通过手工比对和视觉观察
来测量。[0065]为了序列比较，典型地，一个序列担当参考序列，测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机，如果需要，指定子序列坐标，并指定序列算法程序参数。可以使用默认的程序参数，或可以指定备选的参数。序列比较算法然后基于程序参数，计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。
[0066]本文中使用的“比较窗”包括选自由20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150组成的组的任一连续位置数量的区段，其中当两序列最佳比对后，序列可以与相同数量的连续位置的参考序列进行比较。比对序列以进行比较的方法是本领域中公知的。用于比较的最佳序列比对可以，例如，通过Smith & Waterman, Adv.Appl Math.(现代应用数学)2:482 (1981)的局部同源比对算法,通过Needleman & ffunsch, J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)48:443 (1970)的同源比对算法,通过Pearson & Lipman,Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报)85 =2444(1988)的相似方法的搜索，通过计算机化执行这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA，和TFASTA，在Wisconsin Genetics Software Package (威斯康辛州遗传学软件包)，Accelrys中),或通过人工比对和视觉观察来进行。
[0067]适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的例子是BLAST和BLAST2.0 算法，其分别记述在 Altschul 等(Nuc.Acids Res.25 =3389-402,1977)和Altschul等(J.Mol.Biol.215:403-10，1990)中。用于进行BLAST分析的软件可公共地获白国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)(http: / / www.ncb1.nlm.nih.gov / )。该算法包括首先通过识别查询序列中长度W的短词来识别高评分序列对(HSPs)，其在与数据库序列中相同长度的词比对时，匹配或满足一些正值阈值评分。T指邻近词评分阈值(Altschul等，见上文)。这些起始邻近词击中(word hits)担当开始搜索的种子，以发现包含它们的较长的HSPs。词击中以两个方向沿各序列延伸，以直至可以增加累积比对评分。词击中在各方向的延伸中以下时刻停止:累积比对评分通过量X由其最大获得值下降；累积评分变为O或以下，这归因于一个或多个负评分残基比对的累积；或达到各序列的末端。BLAST算法参数W，T，和X确定算法的灵敏性和速度。BLAST程序在默认词`长(W) 11时，使用BL0SUM62评分矩阵(参见HenikofT &Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(美国国家科学院学报)89:10915(1989))比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4，和两条链比较。
[0068]BLAST算法也进行两序列之间相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin &Altschul，Proc.Nat' 1.Acad.Sc1.USA (美国国家科学院学报)90:5873-5787 (1993))。由BLAST算法提供的相似性的一个测量值是最小综合可能性(P (N))，其提供两核苷酸或氨基酸序列之间的匹配偶然发生的可能性指示。例如，核酸被认为与参考序列相似，条件是测试核酸与参考核酸的比较中的最小总和可能性小于约0.2，更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001。
[0069]术语“严格杂交条件”指这样的条件下，在该条件下，探针与其靶子序列，典型地在核酸的复杂混合物中进行杂交，而不与其它序列杂交。严格条件是序列依赖性的且在不同环境中应该不同。较长的序列特别在较高温度下杂交。核酸杂交的广泛指导参见Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic
Probes (生物化学和分子生物学技术-使用核探针的杂交)，"Overview of principles
of hybridization and the strategy of nucleic acid assays (杂交原理和核酸测定策略综述)"(1993)。一般地，高严格条件被选为比特定序列在确定的离子强度pH下热熔点(Tm)低约5-10°C。低严格条件通常被选为比Tm低约15-30°C。Tm是这样的温度(在确定的离子强度、pH、和核浓度下)，在该温度下，50%的与靶标互补的探针平衡地杂交靶序列(当靶序列过量存在时，在Tm，50%的探针平衡地被占据)。杂交条件典型地是那样的，其中盐浓度在pH7.0-8.3下，低于约1.0M钠离子，典型地约0.01-1.0M钠离子浓度(或其它盐)并且温度对于短探针(例如，10-50核苷酸)是至少约30°C且对于长探针(例如，大于50核苷酸)是至少约60°C。严格条件还可以使用添加去稳定剂诸如甲酰胺来实现。为了选择性或特异性杂交，阳性信号是至少两倍背景，优选10倍背景杂交。
[0070]在严格条件下不相互杂交的核酸仍然是基本相同的，条件是它们编码的多肽基本相同。这，例如，在使用遗传密码允许的最大密码子简并创建核酸拷贝时发生。在这样的情形中，核酸典型地在中度严格杂交条件下杂交。示范性“中度严格杂交条件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl，l%SDS缓冲液中，在37°C下杂交和在IX SSC，在45°C下洗涤。示范性“严格杂交条件”包括在40%甲酰胺，IM NaCl，l% SDS缓冲液中，在37°C下杂交和在0.2X SSC,在温度至少约50°C，通常约55°C -约60°C下至少一次20分钟的洗涤，或等价条件。阳性杂交是至少两倍背景。本领域技术人员应该容易认识到，可以使用备选的杂交和洗涤条件来提供类似严格性的条件。
【具体实施方式】
[0071]I?引言
[0072]本发明提供了变体Sso7聚合酶缀合物，其与包含野生型Sso7结构域的Sso7聚合酶缀合物相比，表现出降低的非特异性扩增活性。所述变体Sso7聚合酶缀合物包含至少ー个与变体Sso7结合结构域连接的聚合酶结构域。所述变体Sso7DNA-结合结构域包含在2个位置(对应于SEQ ID NO:2中的K28和/或R43)中的ー个或两个处的氨基酸变化(相对于该位置处的野生型氨基酸)。如在实施例中所证实的，已经证实在这些位置处的许多相对于野生型的不同氨基酸置換会降低非特异性聚合酶活性。非特异性聚合酶活性包括，由于除杂交引物的模板特异性延伸以外的`原因而发生的核酸扩增。
[0073]II?本发明的Sso7结构域
[0074]本发明的聚合酶缀合物包含与天然(野生型)Sso7d序列相比具有氨基酸置換的Sso7多肽序列。Sso7d是得自超嗜热古细菌硫矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)的小型(63个氨基酸，约7kd MW)碱性染色体蛋白。所述蛋白富含赖氨酸，且具有高热、酸和化学稳定性。它以不依赖于序列的方式结合DNA，并且当结合时，会使DNA的Tm在相同条件下増加至多 40 0C (McAfee 等，Biochemistry (生物化学)34:10063-10077，1995)。通常认为Sso7d和它的同源物參与包装基因组DNA并在升高的温度下稳定基因组DNA。Sso7d蛋白序列显示在SEQ ID NO:2中。
[0075]存在几种已知的Sso7d_样蛋白(也被称作“ Sso7蛋白”)，包括、但不限于，得自超嗜热古细菌酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius)的 Sac7a、Sac7b、Sac7d (SEQ IDNO:4)、Sac7e(SEQ ID NO:5);得自 Sulfolobus tokodaii 的 Sto7e (SEQ ID NO:6)，以及得自芝田硫化叶菌(Sulfolobus shibatae)的 Ssh7a 和 Ssh7b(SEQ ID NO:3)(參见，例如，UniProt 数据库登录号:P39476 (Sso7d) ；059632 (Ssh7b) ；P13123 (Sac7d) ；P13125 (Sac7e)；和Q96X56(Sto7e))。这些蛋白与Sso7d具有在78%至98%范围内的同一性。用于本发明中的其它Sso7结构域也可以如下面所述来鉴别。
[0076]如本文中所指出的，本发明提供了在与SEQ ID NO:2的K28和/或R43相对应的位置处相对于天然氨基酸的氨基酸变化。应当理解，这样的位置命名不指示要求保护的分子本身的氨基酸的数目，而是指示当要求保护的分子序列与SEQ ID NO:2最大程度地比对时要求保护的分子残基所在的位置。在变体Sso7结构域的背景下，与Sso7-样蛋白序列的“对应”是基于下述惯例:根据特定序列(即，SEQ ID N0:2)的氨基酸位置编号进行编号，然后以使与SEQ ID NO:2的序列同一性百分比最大化的方式与Sso7-样蛋白序列比对。比对可以手工进行，或者使用序列比较算法进行(例如，使用具有默认参数的NCBI BLAST程序(参见，例如，Altschul 等，Nucl.Acids Res.25:3389-3402, 1997)。与几种含有 SEQ IDNO:2的Sso7-样蛋白的比对的一个例子显示在图1中。对应的序列可以总结如下:
【权利要求】
1.一种Sso7聚合酶缀合蛋白，其包含与聚合酶连接的Sso7结构域；其中: 所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K);和/或 所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)， 其中所述缀合蛋白与其它方面相同的对照缀合蛋白相比具有降低的非特异性扩增活性，在所述对照缀合蛋白中，所述Sso7结构域与SEQ ID N0:2的K28对应的氨基酸是赖氨酸⑷，且所述Sso7结构域与SEQ ID NO:2的R43对应的氨基酸是精氨酸(R)。
2.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中与对照缀合蛋白的非特异性扩增活性相比，所述Sso7聚合酶缀合蛋白的非特异性扩增活性降低至少10%。
3.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2的K28对应的氨基酸不是赖氨酸(K)。
4.根据权利要求3所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2的K28对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、胞嘧啶(C)、脯氨酸(P)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、苯丙氨酸(F)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、精氨酸(R)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)和酪氨酸⑴。
5.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2的R43对应的氨基酸不是精氨酸(R)。
6.根据权利要求5所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2的R43对应的氨基酸选自由以下各项组成的组:丙氨酸(A)、胞嘧啶(C)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、`甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、缬氨酸(V)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和脯氨酸⑵。
7.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶基本上没有3’-5’外切核酸酶活性。
8.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2的前58或60个氨基酸或与SEQ ID NO:2的全长基本(例如，至少60、75、80、85、90或95% )相同。
9.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述Sso7结构域与SEQID NO:2至少90%相同。
10.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶与SEQID NO:33或SEQ ID NO:61 基本(例如，至少 60、75、80、85、90 或 95% )相同。
11.根据权利要求10所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶包含SEQID NO:33 或 SEQ ID NO:61。
12.根据权利要求1所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域具有热稳定的聚合酶活性。
13.根据权利要求12所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是家族A聚合酶结构域。
14.根据权利要求13所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是ATaq聚合酶结构域。
15.根据权利要求12所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域是家族B聚合酶结构域。
16.根据权利要求15所述的Sso7聚合酶缀合蛋白，其中所述聚合酶结构域来自热球菌属(Pyrococcus)。
17.一种反应混合物，其包含权利要求1-16中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。
18.根据权利要求17所述的反应混合物，所述反应混合物进一步包含至少一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸、盐、DNA结合染料、或稳定剂。
19.一种试剂盒，其包含权利要求1-16中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，在含有所述缀合蛋白的相同或不同容器中，所述试剂盒进一步包含以下各项中的至少一种:一种或多种寡核苷酸引物、一种或多种可检测地标记的寡核苷酸探针、缓冲液、核苷三磷酸、盐、DNA结合染料、或稳定剂。
21.—种扩增样品中的靶核酸的方法，所述方法包括:在允许用引物扩增靶核酸的条件下，在反应混合物中温育所述靶核酸，所述反应混合物包含: a.至少一种引物；和 b.权利要求1-16中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白， 由此扩增所述靶核酸。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述方法包括聚合酶链反应(PCR)。`
23.—种核酸，其包含编码权利要求1-16中任一项所述的Sso7聚合酶缀合蛋白的多核苷酸。
24.一种包含重组表达盒的细胞，所述表达盒包含与权利要求23的多核苷酸可操作地连接的启动子。
【文档编号】C12Q1/68GK103562410SQ201280026591
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年2月10日 优先权日:2011年4月8日
【发明者】程曼, 王岩, 约翰·苏利文 申请人:伯乐实验室公司