一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新型果糖苷酶、其编码基因、包含该基因的重组表达载体及其转化体和所述酶的应用。所述的果糖苷酶具有如序列表中SEQ.ID?NO:1所示的氨基酸序列。所述的编码基因具有如序列表中SEQ.ID?NO:2所示的核苷酸序列。本发明还提供包含所述编码基因核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体。该果糖苷酶来源于植物乳杆菌，与其他来源的果糖苷酶相比，该酶不仅具有分解低聚果糖并从中游离果糖基的酶活性，同时其还具有菊粉酶活性及果聚糖酶活性；于其他乳酸菌中异源表达该酶可以使得不具有利用低聚果糖的乳酸菌获得利用低聚果糖的能力。
【专利说明】一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种新型果糖苷酶及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]低聚果糖(Fructooligosaccharides,FOS)又名鹿果低聚糖,是指I~9个果糖基以β -2，I键或β _2，6键连接在蔗糖的D-果糖基上而形成的混合物。作为一种被广泛认可的益生元物质，低聚果糖不能被人体直接消化吸收，当它到达人体胃肠道时，可有选择性地刺激肠道中的有益菌(如双歧杆菌和部分乳酸菌)增殖，同时代谢产生的短链脂肪酸，使肠道内的PH值降低，抑制外源性致病菌和肠道内固有真菌等的生长繁殖，起到调节肠道菌群的作用。
[0003]微生物之所以具有利用低聚果糖的能力是因为它含有能分解低聚果糖糖苷键的酶，即β -呋喃果糖苷酶。β —呋喃果糖苷酶(β -fructofuranosidase, EC3.2.1.26)，又名转化酶，广泛地存在于生物界，属于糖苷酶32家族，具有催化β -呋喃果糖苷分子中非还原端的β_呋喃果糖苷键水解的功能，有的还具有转糖基作用，如用蔗糖作果糖基供体其能将果糖基转移鹿糖生产低聚果糖。乳杆菌双歧杆菌来源的β-呋喃果糖苷酶无转糖基作用，其主要功能是水解低聚果糖等碳源供菌体利用。研究发现，不同来源的β_呋喃果糖苷酶的性质不同，包括底物动力学、底物多样性、最适反应条件等，使得不同菌株利用低聚果糖的能力及特性不同。此外，许多具有益生功能的乳酸菌不具有利用低聚果糖的能力，如生产酸奶的常用菌株保加利亚乳杆菌就不能利用低聚果糖，这就限制了其在人体胃肠道中生长并保持活力。
[0004]因此，基于实际应用的需求，有必要开发新型的果糖苷酶，如果同时还能实现其异源表达，使得不具有利用低聚果糖能力的益生菌具有利用低聚果糖的能力，则具有更大的实际应用价值。`
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是针对现有的果糖苷酶类型还不够丰富，还不能满足实际应用需求的现状，而提供一种新型果糖苷酶、其编码基因、包含该基因的重组表达载体及其转化体和所述酶的应用，该果糖苷酶来源于植物乳杆菌，与其他来源的果糖苷酶相比，该酶不仅具有分解低聚果糖并从中游离果糖基的酶活性，同时其还具有菊粉酶活性及果聚糖酶活性；于其他乳酸菌中异源表达该酶可以使得不具有利用低聚果糖的乳酸菌获得利用低聚果糖的能力。
[0006]本发明提供的技术方案之一是:一种分离的蛋白质，其
[0007](I)氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示；或
[0008](2)为由氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
[0009]本发明中，所述的蛋白质为一种新型的β_呋喃果糖苷酶，在本发明之前未见报道过，其具有高效的果糖苷酶活性，同时还兼有菊粉酶活性及果聚糖酶活性。本发明所述的蛋白质来源于植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum) ST-1II,其可以通过本领域常规的方法获得，如将编码所述蛋白质的基因导入合适的宿主细胞得到能够正常表达所述蛋白质的转化体，然后培养所述的转化体，从培养物中分离所述蛋白质即可。所述的蛋白质还可以通过人工全序列合成而得。
[0010]如本领域技术人员所知:所述蛋白质的氨基酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个氨基酸而得所述蛋白质的同系物，只要该蛋白质的同系物依然能够保持所述蛋白质的功能即可，即在保持所述蛋白质的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性及果聚糖酶活性的前提下，可以进行适当程度的氨基酸序列改变。
[0011]本发明中，所述的蛋白纯化标签为本领域常规所述，较佳地为His纯化标签，即本发明所述的融合蛋白较佳地为由氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质与His纯化标签组成的融合蛋白。
[0012]本发明提供的技术方案之二是:一种分离的核酸，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质。
[0013]其中所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，所述制备方法较佳地包括:从自然界中提取天然存在的编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过基因克隆技术获得编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核酸分子，或者通过人工全序列合成的方法得到编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1DNO:1所示的蛋白质的核酸分子。
[0014]本发明中，所述的核酸优选地具有如序列表中SEQ.1D N0:2所示的核苷酸序列，更优选地，所述核酸的核苷酸序列如序列表中SEQ.1D N0:2所示。
[0015]如本领域技术人员 所知:编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核苷酸序列可以适当引入替换、缺失、改变、插入或增加一个或多个碱基的方式来提供一个多聚核苷酸的同系物，只要该同系物编码的蛋白质依然能够保持氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的功能即可，即在保持氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1DNO:1所示蛋白质的果糖苷酶催化活性、菊粉酶活性及果聚糖酶活性的前提下，可以进行适当程度的核苷酸序列改变。
[0016]本发明提供的技术方案之三是:一种包含上述核酸的重组表达载体。
[0017]其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得，即:将上述核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒，本发明所述载体更优选为质粒pET-28a(+)，即本发明所述的重组表达载体更优选为将上述核酸连接于质粒pET-28a(+)上构建而成。
[0018]本发明提供的技术方案之四是:一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
[0019]其中所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规，如可以通过将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，且使所携带的编码氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示蛋白质的基因可被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为:大肠杆菌(E.coli)，更佳地为大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌DH5 α。将前述重组表达载体转化至E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规的转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0020]本发明提供的技术方案之五是:一种重组乳酸菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氣基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所不蛋白质的外源基因。
[0021]本发明中，所述外源基因的核苷酸序列较佳地如序列表中SEQ.1D N0:2所示，其表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质。
[0022]所述的重组乳酸菌为一种能够利用低聚果糖、获得水解低聚果糖的重组乳酸菌，其为能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的重组乳酸菌。本发明中，所述的乳酸菌为本领域常规所述的不能产生果糖苷酶、不具有利用低聚果糖能力的常规的乳酸菌，优选保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus) ATCCl 1842菌株。
[0023]本发明中，所述的重组乳酸菌可以通过常规方法获得，只要将能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核酸分子(优选核苷酸序列如序列表中SEQ.1D NO: 2所示)导入所述的乳酸菌基因组中，使之稳定表达即可。较佳地，所述的重组乳酸菌为通过穿梭质粒PSIP403将能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核酸分子(优选核苷酸序列如序列表中SEQ.1D N0:2所示)导入所述的乳酸菌基因组中，即:将包含能表达产生氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质的核酸分子的穿梭质粒PSIP403 (重组表达载体pSIP403-sacA)导入所述的乳酸菌中，筛选得到重组乳酸菌，所述的重组乳酸菌能够表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质。本领域技术人员知晓，其他能够携带常规核酸分子的穿梭载体也适用于本发明。
[0024]本发明提供的技术方案之六是:前述氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质作为果糖苷酶、菊粉酶或果聚糖酶的应用。
[0025]本发明中，所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质具有果糖苷酶活性，其能够水解底物非还原末端的β` (2-1)糖苷键，生成果糖；所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质还具有菊粉酶活性，其能够将长链的菊粉水解为果糖或短链的低聚果糖；所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质还具有果聚糖酶活性，其能够水解果聚糖酶中β (2-6)糖苷键，使得细菌来源的果聚糖也得以被利用。由于酶的专一性，其他来源的果糖苷酶主要作用于底物非还原末端的β (2-1)糖苷键，如大部分双歧杆菌的果糖苷酶；而本发明所述的果糖苷酶兼具有果糖苷酶、菊粉酶和果聚糖酶等多种酶活力，使得其可以作用于不同连接键和链长的底物，丰富了其宿主菌的糖类利用多样性，促进其在肠道中的增殖。
[0026]所述的氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质作为植物乳杆菌来源的果糖苷酶目前未见报道过，同时由于该酶兼有菊粉酶活性和果聚糖酶活性，其作为一个新的果糖苷酶的特性也未见报道过。
[0027]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0028]本发明所用试剂和原料除特别说明之外，均市售可得。
[0029]本发明的积极进步效果在于:
[0030]1、本发明所述的果糖苷酶为胞内酶，而其他目前报道的果糖苷酶有的为胞外酶，有的为与胞壁相连接的酶。果糖苷酶在细胞中的位置决定了低聚果糖水解发生的位置，在胃肠道中，低聚果糖在胞外或者胞壁水解会使水解产物被其他肠道菌所利用；而胞内水解则没有这个劣势，从而可以使得低聚果糖的益生功效充分发挥。
[0031]2、并不是所有的乳酸菌都可以利用低聚果糖，有些具有益生功能的乳酸菌不能利用低聚果糖就是因为其不编码可以水解低聚果糖的果糖苷酶。由于兼容性等的差异，在这些菌中异源表达其他来源的果糖苷酶也不一定会使其获得利用低聚果糖的能力。而本发明所述的果糖苷酶于保加利亚乳杆菌ATCC11842中异源表达，可以使得重组菌获得利用低聚果糖的能力，弥补了其不能利用低聚果糖的缺陷。同时，本发明的这一应用也给其他通过基因工程方法改造乳酸菌增加其代谢功能性的研究提供了有益借鉴。
[0032]3、本发明所述的果糖苷酶不具有转糖基能力，不能由蔗糖生成低聚果糖，但是该酶对于短链的低聚果糖有最佳的催化活力，同时兼具外切菊粉酶，外切果聚糖酶和转化酶等多种酶活力，会帮助其宿主菌更好的利用肠道中低聚糖等碳源，促进宿主菌在肠道中的增殖。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1中编号“I”的泳道为PCR产物；编号“2”的泳道为pGEM? -T EasysacA经NdeI和XhoI双酶切后的电泳图；编号“3”的泳道为pET-28a( + ) - sacA经NdeI和XhoI双酶切后的电泳图！M1为DL2000Marker ；M2为IKb ladder。
[0034]图2为重组蛋白表达鉴定及纯化后的电泳结果图，其中，M为蛋白Marker ；1为E.coli BL21-sacA诱导前细胞的破碎上清；2为E.coli BL21-sacA诱导后的细胞破碎上清；3为目的蛋白经Ni2+柱纯化后的电泳结果。
[0035]图3为MALDI T0F/T0F质谱检测蛋白质肽谱与SacA蛋白序列的对比图，加粗片段为液质联用得到的肽段，下划线片段为表达载体引入的肽段。
[0036]图4为pH (A)、温 度(B，C)、金属离子(D)对重组SacA蛋白酶活的影响结果图。
[0037]图5为SacA水解低聚果糖产物的HPLC分析结果图，SacA在37 °C分别作用于蔗糖(A)，蔗果三糖(B)，蔗果四糖(C)，蔗果五糖(D)O(I)，10(11)，30 (III)和60 (IV)分钟后，用配有氨基柱的HPLC检测，其中，各缩写词为:Glc，葡萄糖；Fru，果糖；Suc，蔗糖；1_K，蔗果三糖1-kestose ;Nys,鹿果四糖；F_nys,鹿果五糖。
[0038]图6为保加利亚乳杆菌ATCCl 1842野生型菌株(左图)和含有pSIP403_sacA的重组菌株在含有1%的低聚果糖的改良MRS培养基上(含有25ng/mL的IP-673，10 μ g/mL的红霉素和30mg/L的溴甲酚紫，右图)的生长情况。
[0039]图7为表达载体pET_28a ( + ) sack的构建示意图。
[0040]图8为表达载体pSIP403_sacA的构建示意图。
【具体实施方式】
[0041]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0042]实施例1植物乳杆菌中β -呋喃果糖苷酶位置的确定和粗酶的提取
[0043]将植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)ST-111 于 37°C 培养 24h 后，离心(4°C,12，OOO Xg, IOmin)收集上清与菌体。上清用0.45 μ m的膜过滤除菌后，经25kDa超滤膜超滤浓缩至原体积的1/20，即为发酵液上清。菌体用50mM PBS (pH=6.0)离心洗涤2次后，加入溶菌酶至2mg/mL，37°C作用lh。在冰浴中超声波间歇破碎8min (400W，超声5s，间歇5s)，后离心(4°C，12，OOOXg, IOmin)分别收集上清液与沉淀。沉淀重悬到等体积的上述PBS中，即为破碎细胞沉淀。上清液用截留分子量为25kDa超滤膜超滤浓缩至原体积的1/5，即为细胞破碎上清。分别测定发酵液上清，细胞破碎上清和沉淀的酶活，结果见表1。从结果可以看出，酶活几乎全部存在于细胞破碎上清中，表明该酶是胞内酶。
[0044]表1植物乳杆菌中β -呋喃果糖苷酶酶活分布
[0045]
【权利要求】
1.一种分离的蛋白质，其特征在于，其 (1)氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示;或 (2)为由氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质与蛋白纯化标签组成的融合蛋白。
2.一种分离的核酸，其特征在于，其编码氨基酸序列如序列表中SEQ.1D N0:1所示的蛋白质。
3.如权利要求2所述的核酸，其特征在于，其核苷酸序列如序列表中SEQ.1D NO:2所/Jn ο
4.一种包含如权利要求2或3所述核酸的重组表达载体。
5.如权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体通过将如权利要求2或3所述核酸连接于质粒pET-28a(+)上构建而成。
6.一种包含如权利要求4所述重组表达载体的重组表达转化体。
7.如权利要求6所述的重组表达转化体，其特征在于，所述重组表达转化体通过将如权利要求4所述重组表达载体转化至E.coli BL2KDE3)中制备而得。
8.—种重组乳酸菌，其特征在于，其基因组中含有能表达氨基酸序列组成如序列表中SEQ.1D NO:1所示蛋白质的外源基因。
9.如权利要求8所述的重 组乳酸菌，其特征在于，所述的乳酸菌为保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus) ATCC11842 菌株。
10.氨基酸序列如序列表中SEQ.1D NO:1所示的蛋白质作为果糖苷酶、菊粉酶或果聚糖酶的应用。
【文档编号】C12N15/74GK103555690SQ201310521419
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月28日 优先权日:2013年10月28日
【发明者】陈臣, 周方方, 任婧, 刘景 , 张红发, 顾瑾麟, 王渊龙, 董懿樱 申请人:光明乳业股份有限公司