一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用，属于生物【技术领域】。本发明选择干酪乳杆菌作为研究对象，通过分离干酪乳杆菌的噬菌体，预测并克隆其裂解基因，将含有克隆得到的裂解基因的重组载体转化干酪乳杆菌，诱导裂解基因表达后制成菌影。本发明以干酪乳杆菌菌影作为抗原传递载体使用，做到了真正意义上的安全可靠。此外，干酪乳杆菌菌影可通过发酵大量生产，冻干后在室温下可保存较长时间，为进一步应用于生产实践降低了成本，也为进一步设计新型安全有效的药物，特别是疫苗的递送系统，从而应用于预防及治疗疾病提供了一种新的思路和方法。
【专利说明】一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用
[0001]相关申请案的交叉参考
[0002]本申请案要求2012年10月30日申请的，申请号为201210424842.0，发明名称为“一种干酪乳杆菌菌影及其制备方法和应用”的中国专利申请案的优先权，其说明书是以引用的方式全部并入本文中。
【技术领域】
[0003]本发明涉及一种细菌菌影的制备方法，由该方法制备得到的菌影及其应用。特别涉及一种干酪乳杆菌菌影的制备方法及由该方法制备得到的细菌菌影。属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0004]细菌菌影是将细菌细胞壁裂解、去除细胞内容物之后形成的细菌空壳。它具有完整的细菌表面抗原结构，能直接作为疫苗使用。同时，菌影还是一种良好的载体，其残留的内膜结构在重新封闭之后能够用于装载生物大分子。以往的菌影制备均利用Φχ174噬菌体表达的一种裂解革兰氏阴性菌细胞壁的蛋白一E蛋白。将E蛋白的基因构建到可诱导的表达载体中，转化革兰氏阴性细菌，在合适的条件下诱导E蛋白表达，可使宿主菌的内膜和外膜融合，形成裂解通道，使细胞内容物由通道流出，再离心洗去细胞内容物后即可得到菌影。用这种方法，目前已经成功地制备了幽门螺旋菌、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、弗氏志贺氏菌、霍乱弧菌、胸膜肺炎放线杆菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌等细菌的菌影。
[0005]到目前为止，已报道的菌影均采用致病菌制备，而由于菌影制备技术还不能保证菌体100%完全裂解。因此，致 病菌制备的菌影作为载体应用时，存在散播病原和感染的危险，因此在实践中不能推广应用。
【发明内容】
[0006]针对目前致病菌研制菌影的不足，本发明的目的在于提供一种安全、有效的能够作为载体使用的细菌菌影，并提供制备所述的菌影的方法。
[0007]为了达到以上目的，本发明采用的技术手段为:
[0008]本发明选择干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)作为对象进行探索性研究。通过分离干酪乳杆菌的噬菌体，预测并克隆其裂解基因，同时利用干酪乳杆菌作为宿主菌，诱导裂解基因表达后制成菌影。
[0009]分离得到的干酪乳杆菌噬菌体属于双链DNA噬菌体，其编码的裂解相关酶类涉及到两个蛋白，即穿孔素(holin)和裂解素(Iysin)，该两个蛋白共同组成了 “两组分裂解盒”。穿孔素为一种小的疏水性膜蛋白，穿孔素单体迅速组装成多聚体，并在膜上形成非特异性的孔洞。通过孔洞，裂解素得以穿过膜到达周质空间降解肽聚糖而裂解细胞。
[0010]根据NCBI已公布的L.caseiATCC393噬菌体全基因组序列中编码裂解基因的ORF序列设计引物，提取噬菌体基因组DNA，并以其为模版，扩增裂解功能基因，分别克隆了编码穿孔素(holin)、裂解素(Iysin)以及“两组分裂解盒”的基因，并将其分别与分泌表达的载体质粒PPG612进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌L.caseiATCC393细胞内，在木糖诱导下进行表达，摸索优化表达条件，提高菌影裂解率，选择最佳的诱导条件进行诱导，将培养物处理后，制成菌影悬液。通过对制备菌影的基本特性进行鉴定，发现通过表达裂解素(Iysin)以及“两组分裂解盒”而制备得到的菌影，其裂解程度无法达到令人满意的程度，例如表达“两组分裂解盒”而制备得到的菌影其裂解程度较高，制备的菌影较难保持完整的形态。而通过表达穿孔素(holin)制备得到菌影，在诱导88h时，其裂解率为97.12%，并且能够保持完整的细囷形态。[0011]在进行了以上研究的基础上，本发明人提出了本发明。
[0012]本发明为一种干酪乳杆菌菌影的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
[0013](I)将噬菌体穿孔素基因克隆到干酪乳杆菌表达载体中，得到用于转化干酪乳杆菌的重组表达载体；
[0014](2)将步骤(1)得到的重组表达载体电转化干酪乳杆菌，得到重组干酪乳杆菌；
[0015](3)对步骤(2)得到的重组干酪乳杆菌进行培养，诱导噬菌体穿孔素蛋白的表达，获得所述的干酪乳杆菌菌影。
[0016]在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌表达载体为乳酸菌表达载体PPG612.1。
[0017]在本发明中，优选的，所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L.casei 393。
[0018]其中，所述的干酿乳杆菌L.casei 393 (Lactobacillus casei ATCC 393)已记载于产气荚膜梭菌α毒素重组干酪乳杆菌表达及其免疫学分析，李晓静，东北农业大学，2009年一文中，公众可通过商业途径购买得到。
[0019]在本发明中，优选的，所述的表达噬菌体穿孔素蛋白的基因的序列如SEQ ID N0.1所示。
[0020]在本发明中，优选的，步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10 μ g/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37 °C静置、厌氧培养12-24小时，取培养菌液按体积比1:10-20比例接种于含有10 μ g/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养5-10小时，取出一定体积的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于相同体积的含有10 μ g/mL氯霉素的含2% (w/w)木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37°C诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为40-90h。
[0021]更优选的，步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10 μ g/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37°C静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1:20比例接种于含有10 μ g/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7-8小时，取出50ml的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml的含有10 μ g/mL氯霉素的含2% (w/w)木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37°C诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为88小时。
[0022]进一步的，本发明还提供了由以上所述的制备方法制备得到的干酪乳杆菌菌影。及所述的干酪乳杆菌菌影在制备用于转载生物大分子的载体中的应用，所述的生物大分子可以包括核酸，蛋白质等。
[0023]本发明的优点在于以益生菌作为研究对象，通过分离干酪乳杆菌噬菌体，表达其裂解基因，来制备干酪乳杆菌菌影。致病菌制备的菌影作为载体应用时，由于不能保证菌体100%完全裂解，存在散播病原和感染的危险，因此在实践中不能推广应用。以干酪乳杆菌菌影作为抗原传递载体使用，即使菌体裂解不完全，也没有感染性，做到了真正意义上的安全可靠。同时，干酪乳杆菌细胞壁中的胞壁酰二肽具有很好的佐剂作用，能明显加强异质性抗原的免疫原性。乳酸菌虽可作为受体菌插入多种外源基因，但只能实现对外源蛋白的表达，而对核酸、蛋白质等生物大分子类抗原则无法进行携带和传递。而且，用乳酸菌表达不同外源蛋白时，需用基因工程技术重复插入不同外源基因再进行诱导表达，操作复杂，工作量大。此外，干酪乳杆菌菌影可通过发酵大量生产，冻干后在室温下可保存较长时间，为进一步应用于生产实践降低了成本。通过本研究的开展，为提高DNA疫苗的免疫水平，提供一个新的思路和技术平台，也为其他革兰氏阳性菌菌影的研制提供实验数据和理论依据。同时，为进一步设计新型安全有效的抗原、药物和疫苗的递送系统，从而应用于预防及治疗疾病方面提供一种新的思路和方法。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为噬菌斑形态观察；
[0025]图2为噬菌体的形态观察；
[0026]1.Hindlll/bacteriophage Lambda DNA marker ;2.卩遼菌体的基因组；3.未经连接处理的噬菌体基因组酶切图谱；4.经连接处理的噬菌体基因组酶切图谱；5.2000 bp DNAmarker
[0027]图3为噬菌体基因组经限制性内切酶Hind III消化后的酶切图谱；
[0028]图4为TMHMM预测的Hocb中跨膜区；
[0029]图5为Lycb N端信号肽的预测；
[0030]图6为裂解功能基因的PCR扩增结果；
[0031]1.DNA Marker DL2000;2.holin.PCR 鉴定结果;3.5.7 阴性水对照结果 4.1ysin.PCR鉴定结果6.holin-lysin.PCR鉴定结果。
[0032]图7为三种重组载体单双酶切鉴定结果；
[0033]1、6.DNA Marker DL8000 ；2.pPG612_hocb经BamHI 单酶切结果；3.pPG612_hocb经BamH1、XhoI 双酶切结果；4.pPG612-lycb 经 BamHI 单酶切结果；5.pPG612-lycb 经 BamH1、XhoI 双酶切结果；7.pPG612-hocb_lycb 经 BamHI 单酶切结果；8.pPG612-hocb_lycb 经BamHI和XhoI双酶切结果。
[0034]图8为重组干酪乳杆菌诱导后上清的SDS-PAGE分析；
[0035]1.pPG612-hocb/L.casei393 诱导 48h 后上清 2.pPG612_lycb/L.casei393 诱导48h 后上清 3.pPG612-hocb-lycb/L.casei393 诱导 48h 后上清 4.pPG612/L.casei393 诱导48h后上清
[0036]图9为重组干酪乳杆菌诱导过程中裂解情况；
[0037]图10为形成的菌影的电镜观察结果；
[0038]A.pPG612_hocb/L.casei393 诱导前电镜观察结果；
[0039]B.pPG612_hocb/L.casei393 诱导 48h 后电镜观察结果；
[0040]图11为qPCR检测标准品和菌影装载量的扩增曲线和溶解曲线；
[0041]A.标准品的扩增曲线；B.标准品的溶解曲线；C.样品的溶解曲线的扩增曲线；D.样品的溶解曲线；
[0042]图12为标准品和样品基因qPCR扩增产物；
[0043]1.标准品的扩增结果；2.3.样品扩增结果；4.引物PCR对照
[0044]图13为qPCR标准曲线的绘制结果。
【具体实施方式】
[0045]下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
[0046]实施例1干酪乳杆菌菌影的制备及基本特性的鉴定
[0047]1.材料与方法
[0048]1.1试验材料
[0049]1.1.1质粒、菌种
[0050]干酪乳杆菌L.casei 393 (Lactobacillus casei ATCC 393)由荷兰 NIZO 研究所惠赠，公众也可通过商业途径购买得到；大肠杆菌感受态JM109、pMD18-T Simple载体购自大连宝生物工程有限公司。
[0051]1.1.2分子生物学试剂
[0052]Ex Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶购自TaKaRa公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司，质粒小量制备试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。
[0053]1.1.3引物合成
[0054]应用oligo6.0软件设计引物，引物P1、引物P2用于从噬菌体的基因组上扩增穿孔素(hocb)基因片段；引物P3、引物P4用于从噬菌体基因组上扩增裂解素(Iycb)基因片段；引物P1、引物P4用于从噬菌体基因组上扩增裂解盒基因(hocb-lycb);引物P5、引物P6用于从质粒pMD-18T-hocb_lybc上扩增两端含有BamH1、XhoI酶切位点的穿孔素(hocb)基因片段；引物P7、引物P8用于从质粒pMD-18T-hocb-lybc上扩增两端含有BamH1、XhoI酶切位点的裂解素(Iycb)基因片段；引物P5、引物P8用于从质粒pMD-18T-hoCb-lybC上扩增两端含有BamH1、XhoI酶切位点的裂解盒基因(hocb-lycb);引物P9和引物PlO用于从装载的质粒(PHW2000-HA)上扩增一段166bp的目的片段进行qPCR。引物由上海生物工程有限公司合成，引物序列见表1。
[0055]表1引物序列
[0056]
【权利要求】
1.一种干酪乳杆菌菌影的制备方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将干酪乳杆菌噬菌体穿孔素基因克隆到干酪乳杆菌表达载体中，得到用于转化干酪乳杆菌的重组表达载体； (2)将步骤(1)得到的重组表达载体转化干酪乳杆菌，得到重组干酪乳杆菌； (3)对步骤(2)得到的重组干酪乳杆菌进行培养，诱导噬菌体穿孔素蛋白的表达，获得所述的干酪乳杆菌菌影。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于所述的干酪乳杆菌表达载体为乳酸菌表达载体 PPG612.1。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌L casei 393。
4.按照权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述的噬菌体穿孔素基因的序列如 SEQ ID N0.1 所示。
5.按照权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10 μ g/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37°C静置、厌氧培养12-24小时，取培养菌液按体积比1:10-20比例接种于含有10 μ g/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养5_10小时，取出一定体积的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于相同体积的含有10μ g/mL氯霉素的含2%(w/w)木糖，且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37°C诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为40-90h。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述的培养是挑取重组干酪乳杆菌pPG612-hocb/L.casei393接种于含有10 μ g/mL氯霉素的5mL MRS液体培养基中，37°C静置、厌氧培养12小时，取培养菌液按体积比1:20比例接种于含有10 μ g/mL氯霉素的MRS扩大培养基中，培养7-8小时，取出50ml的菌液，离心收集菌体沉淀，将收集的菌体沉淀接种于50ml的含有10 μ g/mL氯`霉素的含2% (w/w)木糖,且不含葡萄糖的MRS液体培养基中，37°C诱导裂解基因表达，使细菌打孔，诱导时间为88小时。
7.按照权利要求1-6任一项所述的制备方法制备得到的干酪乳杆菌菌影。
8.权利要求7所述的干酪乳杆菌菌影在制备用于转载生物大分子的载体中的应用，所述的生物大分子包括核酸、蛋白质。
【文档编号】C12R1/245GK103555754SQ201310521441
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2012年10月30日
【发明者】乔薪瑗, 李一经, 唐丽杰, 葛俊伟, 兰宇 申请人:东北农业大学