一种维生素k2及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种维生素K2及其制备方法，该方法利用1-羟基-2-萘甲酸抗性黄杆菌株HNA12-D进行发酵培养，通过碳源甘油、氮源蛋白胨以及前体物质的分批补料，获得维生素K2在菌体内的高效代谢，并采用有机溶剂萃取，大孔树脂联合硅胶柱提取分离维生素K2，提高了产品的收率和纯度。本发明的黄杆菌HNA12-D经发酵培养120～144小时后，维生素K2粗品的总产量为200～600mg/L，经吸附层析后，产品的纯度达到80～99%，与现有技术相比，其产量和纯度都有大幅提高，并能应用于工业化生产中。
【专利说明】一种维生素K2及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及的是一种维生素K2，尤其涉及的是一种维生素K2及其制备方法。
【背景技术】
[0002]维生素K (VK)是一族含有共同化学结构(2-甲基-1，4-萘醌环)的物质的统称，根据萘醌环3’位置所连接侧链化学结构长度的不同，VK又分为不同的类别，天然存在的VK主要有两种类型，即维生素Kl (叶绿醌类，简称PK)和维生素K2 (甲萘醌类，简称MK)，都属于脂溶性维生素，均可由微生物合成。维生素K2的化学结构式为2-甲基-3-烯基-1，4-萘醌，分子式为C16H16O2.(C5H8)n，依据C-3上异戊二烯侧链长度的不同，维生素K2可分为14种，通常以MK-n表示，其中n指的是侧链上异戊二烯单元的个数，其中利用黄杆菌发酵产生的维生素K2的主要成分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种，其主要成分的分子式分别为:C31H40O2, C36H48O2, C41H56O2,结构式如下所示:
[0003]
【权利要求】
1.一种维生素K2的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)取黄杆菌HNA12-D接种于斜面培养基中，30~38°C下培养24小时进行活化，然后置于4°C下保藏2~15天，获得活化的黄杆菌HNA12-D的斜面保藏菌； (2)取上述斜面保藏菌接种于种瓶培养基中，在30~38°C下摇瓶培养24~48小时，获得种瓶培养物； (3)取种瓶培养物接种于发酵培养基中，置于28~38°C下发酵培养120~144小时，获得发酵液，发酵培养期间每隔20~30小时补加营养物质，所述营养物质为甘油、蛋白胨和维生素K2生物合成的前体物质； (4)取上述发酵液，加入絮凝剂进行絮凝，离心，收集沉淀，获得湿菌体； (5)将湿菌体放在_15°C低温下冷冻3~10分钟，然后在室温中融化； (6)重复上述步骤(5)2~6次，使湿菌体的细胞经反复冻融而破碎，获得破碎菌体； (7)取上述破碎菌体，先用有机溶剂进行萃取，获得维生素K2粗品，再用大孔吸附树脂对维生素K2粗品进行粗分，最后用硅胶柱精制，获得维生素K2的纯品提取液； (8)将上述纯品提取液干燥，获得所述维生素K2的纯品。
2.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的斜面培养基配方为:甘油8~12g/L，蛋白胨8~12g/L，酵母提取物1.5~4.5g/L，氯化钠2~6g/L，磷酸氢二钾2~10g/L，硫酸镁0.1~4g/L，琼脂20g/L ； 所述步骤(2)的种瓶培养基配方为:甘油4~10g/L，蛋白胨4~10g/L，酵母提取物1.5~3.5g/L，氯化钠2~5g/L，磷酸氢二钾2~8g/L，硫酸镁0.05~5g/L ； 所述步骤(3)的发酵培养基配方为:甘油4~10g/L，蛋白胨4~10g/L，酵母提取物1.5~3.5g/L,氯化钠2~5g/L,磷酸氢二钾2~8g/L,硫酸镁0.05~5g/L,聚氧乙烯油醚0.5 ~1.5g/L。
3.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，斜面保藏菌的接种量为每50mL种瓶培养基接种0.1~0.5立方厘米的斜面保藏菌。
4.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，种瓶培养物的接种量占发酵培养基的体积百分比为4~10%。
5.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，营养物质添加的重量百分比为:甘油0.05~0.15%，蛋白胨0.05~0.15%，前体物质0.005~0.05%，所述前体物质为异戊二烯、多聚异戊二烯、松柏油、松香、1，4- 二羟基-2-萘甲酸、1-羟基-2-萘甲酸、甲萘醌、对苯醌、对羟基萘中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中的絮凝剂为明矾、聚合氯化铝、聚丙烯酰胺、亚铁氰化钾或硫酸锌。
7.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中的有机溶剂为正己烷、异丙醇、甲醇、正丁醇中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中的大孔吸附树脂的型号为HZ816、HZ807、HZ806、HZ818或HZ820。
9.如权利要求1所述的一种维生素K2的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)的硅胶柱精制中，洗脱溶剂为体积比为10~20:1的正己烷与乙酸乙酯混合液，洗脱流速为0.5~.4.5BV/h0
10.一种利用如权利要求1~9任一所述的维生素K2的制备方法制备获得的维生素K2，其特征在于，所述维生素K2的组分为MK-4、MK-5或MK-6中的一种或多种。
【文档编号】C12R1/20GK103571897SQ201310521459
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】郑之明, 刘艳, 王丽, 王鹏, 赵根海, 刘会, 李哲敏, 吴荷芳, 刘红霞, 檀沐 申请人:中国科学院合肥物质科学研究院