一种基于分段收集的亲和核酸分子的筛选方法
【专利摘要】本发明建立了一种快速的亲和核酸分子的筛选方法，所述方法包括：将所述靶分子与待筛选的文库分子混合后，通过毛细管电泳或者色谱技术分离，特征是在收集复合物时分成多段进行分段收集，然后将分段收集的多份样品分别进行荧光定量PCR扩增；通过荧光定量PCR的方法确定所述靶分子与靶核酸分子所形成的复合物所在的位置，从而快速获得与靶分子高亲和性结合的靶核酸分子。该方法可以广泛应用于核酸适配体筛选、启动子筛选等方面，大大提高筛选效率。
【专利说明】—种基于分段收集的亲和核酸分子的筛选方法
【技术领域】
[0001]本发明属于一种筛选分离方法，特别是从一个混合的核酸分子库中筛选并分离出具有某种特性的分子的方法。
【背景技术】[0002]核酸适配体是一类能够与小分子、蛋白、细菌和细胞等多种靶标结合的单链DNA或者RNA分子，由于性质类似抗体，并且相对抗体而言具有多种优势:靶标广泛、分子量小、生产容易、质控简单、应用广泛、存储和运输方便等，因此受到广泛的重视。筛选获得适配体的技术被称作 SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment)技术。但如何获得适配体一直是适配体广泛应用的瓶颈。毛细管电泳(CapillaryElectrophoresis, CE)技术因其高效的分离效率和微量的样品用量，在筛选核酸适配体时效率明显远远高于其它技术。利用毛细管电泳筛选核酸适配体的技术称为CE-SELEX技术。2004年Mendonsa，S.D.(JACS.126，20-21，2004)报道毛细管电泳技术可以在3_4轮筛选而获得适配体。2006 年，Berezovski, M.(JACS.128，1410-1411，2006)报道的 N0N-SELEX 技术，连续分离三次，即可筛选出高亲和力的核酸适配体。2012年，新加坡国立大学化学系的Li SF实验室也报道利用N0N-SELEX技术筛选出牛过氧化氢酶的适配体。尽管这些技术可以快速获得核酸适配体，但迄今为止，N0N-SELEX只有少数几篇文献报道。CE-SELEX尽管报道的相对较多，但实际研究中发现，仍存在不少问题，成功的实例明显少于磁珠法筛选。
[0003]在常规的CE-SELEX技术中，一般是摸索一个分离条件，该条件必须能够将靶分子和随机的DNA文库或RNA文库很好地分开。实际筛选时将靶分子与待筛选的文库混合，在两者之间可能存在复合物的区域进行收集。由于复合物准确的位置是未知的，所以收集时需要收集较宽的窗口，这样会导致收集物中有一些并非结合的复合物，而是游离的文库分子，从而导致筛选效率降低。N0N-SELEX技术通过连续多次收集来减少收集到非结合分子的概率。该方法由于实际使用的库容很小，且反复收集容易导致污染，使得该方法的成功率极低。
【发明内容】
[0004]本发明的目的就是建立一种从随机的核酸文库中快速高效地分离与靶分子高亲和性结合的核酸分子的方法。
[0005]本发明的方法包括下述步骤:
[0006](I)将靶分子与待筛选的文库混合后，通过毛细管电泳或者色谱技术分离，特征是在收集复合物时分成多段进行分段收集，然后将所有收集的样品分别进行荧光定量PCR扩增；
[0007](2)根据荧光定量PCR扩增的结果，可以判断不同收集组分中模板量的多少，从而确定复合物峰所在的位置；
[0008](3)将出现复合物峰的管中的收集产物进行放大扩增，制备得到富集的文库，可以直接进行亲和力测试或者重复进行下一轮筛选，直到测得的亲和力达到预期为止。
[0009]本发明可以用于筛选高亲和力的核酸适配体，也可以用于筛选启动子结合序列。
[0010]本发明初始使用的文库，可以是单链的DNA文库分子、双链的DNA文库分子，或者是RNA文库分子。文库分子类型不同，制备富集后的文库分子所用的方法略有不同:如果原始的样品是单链DNA，得到PCR产物后，需要经过单链制备步骤；如果原始样品是RNA，还需要经过转录步骤；如果原始核酸是双链DNA，通常只需经过纯化即可；
[0011] 上面所说的分段收集，可以分成两段以上；具体分成多少段进行收集，本领域技术人员可以根据分离的效率和操作的便捷性和对污染的控制能力来确定；通常可以选择在预定收集区域分成5-15段进行收集。
[0012]本发明中尽管并未直接测试利用液相色谱技术和毛细管电色谱等分离技术结合分段收集来进行筛选，但通过类比分析知道，结合分段收集，同样可以提高这些技术在筛选未和核酸分子方面的效率。
[0013]综上所述，本发明提供下述:
[0014]1.一种快速分离与靶分子高亲和性结合的核酸分子的方法，所述方法包括:将所述靶分子与待筛选的文库分子混合后，通过毛细管电泳或者色谱技术分离，特征是在收集复合物时分成多段进行分段收集，然后将分段收集的多份样品分别进行荧光定量PCR扩增；通过荧光定量PCR的方法确定所述靶分子与靶核酸分子所形成的复合物所在的位置，从而快速获得与靶分子高亲和性结合的靶核酸分子。
[0015]2.根据第I项所述的方法，其中所述分段收集是分成两段以上进行收集。
[0016]3.根据第I项所述的方法，所选用的文库分子是单链DNA文库分子、双链DNA文库分子或RNA文库分子。
[0017]4.根据第I项所述的方法，其中当使用RNA文库进行筛选和分离时，所述方法还包括将收集到的所述靶分子与靶RNA分子所形成的复合物进行反转录的步骤，然后再通过荧光定量PCR的方法确定所述靶分子与靶RNA分子所形成的复合物所在的位置。
[0018]本发明与现有筛选技术相比的优点在于:
[0019]1.本发明与现有技术相比，大大提高了富集目标分子的效率。原因在于采取了多段收集的方法，每一管中收集的样品较少，所以收集到的非特异结合分子也少，污染也较少；由于复合物只会分布在少数几管中，此时目标产物与污染分子相比就占据绝对优势；
[0020]2.该技术另一个优势是，借助了 PCR的放大扩增作用来实现对目标峰的检测，使得我们可以在第一轮筛选中就能确定复合物所在的位置；以往的技术，都是利用紫外或激光诱导荧光检测技术判断复合物所在位置；由于紫外灵敏度很低，很难检测到复合物；激光诱导荧光检测技术尽管灵敏度很高，但在筛选的初期，目标分子数极少，即便激光诱导荧光技术仍不能检测出复合物所在位置，而本发明中，将收集的样品先通过PCR扩增放大百万倍，此时非常容易检测到复合物所在位置。
[0021]3.在我们的比较实验中，以链霉亲和素为靶标，筛选与之结合的单链DNA核酸适配体，采用传统的技术需要经过三轮才能检测到明显的亲和力，而采用本方法，只需一轮即可获得较高亲和力的核酸适配体。
[0022]4.本方案与N0N-SELEX相比，方法的可靠性更高，抗污染的能力更强；N0N_SELEX技术通过连续多次分离，一是目标分子数极少，极易引起污染，二是操作步骤多，也容易引入污染；本方案中整个筛选过程可以利用毛细管电泳仪，全自动完成，减少了人为操作和干扰，降低了污染，提高了方法的稳定性、可靠性，同时成功率也大大提升 。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显。
[0024]图1:本发明方法(简称fCE-SELEX)分段收集时对应的电流变化图:
[0025]横轴表示时间，刻度单位为分钟，纵轴表示电流值，刻度单位为微安；从左至右分成12段，分别表示12次收集；图中两管收集之间电流为零的时间为切换收集管的时间。可以根据电流的变化，判断分段收集正确与否。
[0026]图2:本发明方法fCE-SELEX分段收集样品的荧光定量PCR扩增结果图，横轴表示的扩增循环数，纵轴为荧光值；图中数字表示收集的管号，未标记的是其它管样品和对照；其中10号管、3号管先于其它管起跳，说明这两管中核酸分子的数目多于其它管，是复合物所在的位置。
[0027]图3:亲和力比较的图谱(常规CE-SELEX的第三轮产物和分段筛选的第一轮产物进行比较)，根据亲和力比较两种方法的筛选效果。fPl表示采用本发明的技术fCE-SELEX一轮分段筛选获得的文库；nP3表示常规CE-SELEX经过三轮筛选获得的文库分子，图中横轴表示电泳的时间，刻度单位为分钟，纵轴表示检测到的荧光信号。复合物峰面积所占总峰面积比例与亲和力大小正相关。由于两者复合物峰所占比例相当，故两者亲和力接近。
[0028]图4:利用凝胶阻滞实验，比较经过两种方法筛选的双链DNA分子与转录因子结合的情况
[0029]第I泳道为分子量标准；自上至下，条带大小依次为200pb、IOObp和50bp ；
[0030]第2泳道为常规CE方法筛选三轮的文库分子(nP3)；
[0031]第3泳道为nP3中加入等分子数的靶蛋白分子；靠上的条带为复合物条带；下方的是文库分子的条带；
[0032]第4泳道为分段收集筛选的第一轮文库分子(fPl)中加入等分子数的靶蛋白分子；靠上的条带为复合物条带；下方的是文库分子的条带；
[0033]第5泳道为分段收集筛选的第一轮文库分子(fPl)；
[0034]第6泳道为初始的文库分子，用作对照；
[0035]第7泳道为初始的文库分子中，加入靶蛋白分子；
【具体实施方式】
[0036]下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
[0037]实施例1.下面以筛选链霉亲和素为例来进行说明，并将本发明的方法(fCE-SELEX)与传统的毛细管电泳适配体筛选(nCE-SELEX)技术进行对比。
[0038]一、基于分段收集的fCE-SELEX方法筛选链霉亲和素(SA)的核酸适配体
[0039]1、待筛选的核酸文库为带荧光标记的单链DNA分子，长度为80个碱基，两端各20碱基为引物区，中间为随机序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，溶解于筛选缓冲液(PH8.2硼砂缓冲液+5mM MgCl2)中，终浓度为25uM ；[0040]2、靶蛋白分子为链霉亲和素(SA)0.1ug ；
[0041]3、向20ul25uM的荧光核酸分子文库中加入0.1ug链霉亲和素，室温孵育10分钟；
[0042]4、采用毛细管电泳仪进行分离，分离条件为:毛细管长49厘米，有效长度为39厘米，内径 75um;先用 IOOmM NaOH 冲洗毛细管 30psi3min，再用 IOOmM HCl 清洗 30psi3min，最后用筛选缓冲液冲洗毛细管30psi5min ;上样:lpsi压力下,进样5秒中，然后在200v/cm的条件下电泳。根据单独进样链霉亲和素和核酸的出峰时间，在出口处分12管收集第9至13.6分钟的样品；如图1所示，黑色曲线表示电流变化，电流中断表示切换样品收集管，共收集12管。
[0043]5、将收集的所有样品进行荧光定量PCR扩增，扩增条件为94°C 10秒，60°C 10秒，720C 30秒，共扩增30个循环；根据每管中扩增产物的Cq值进行判断，第3管和第10管中模板数明显多于其它几管，应该是复合物峰所在位置；见图2。进一步将PCR产物进行放大扩增，制备单链核酸，进行亲和力测定；并与传统CE-SELEX方法的筛选结果进行对比，如图3所示。结果表明利用改进的方法筛选I轮，效果与常规方法筛选3轮的效果接近，充分说明该方法的优越性。
[0044]二、常规CE-SELEX方法筛选链霉亲和素(SA)的和核酸适配体
[0045]I)常规的CE-SELEX筛选方法在分离上与本发明中的方法并无明显差异，因此可以参照上述条件进行筛选；
[0046]2)常规CE-SELEX筛选时，在一管中收集第9分钟至第14分钟之间的样品，然后进行扩增；进一步将PCR产物进行放大扩增，制备单链，作为下一轮筛选用的文库分子；
[0047]3)重复进行上述筛选过程。经过三轮筛选后，制备单链进行检测所得文库分子的亲和力。
[0048]三、亲和力对比检测结果
[0049]根据亲和力检测结果，分段收集经过一轮筛选，所获得的富集后的文库分子(fPl)与常规CE-SELEX第三轮获得的文库分子(nP3)亲和力相当。
[0050]取相同浓度的两个文库，加入相同分子数的靶分子，孵育相同时间，用CE测试复合物峰的大小。根据复合物峰的大小可以比较出两者亲和力的差异。由图3可以看出，两者复合物峰大小基本一致，表明亲和力接近。由此说明，分段收集的方法要明显优于常规的筛选方法，可以大大提高筛选效率。
[0051]四、对于其它靶分子，只要根据分离情况，改变一下收集的范围和收集的管数即可。
[0052]实施例2、利用分段收集筛选启动子结合序列
[0053]I)将单链的随机文库分子(购自生工生物工程(上海)股份有限公司)进行5个循环的扩增，确保所有分子均转变为双链分子；分离纯化获得用于筛选的双链文库分子；
[0054]2)分尚条件同实施例1，将祀标分子(S0X2)和双链DNA文库分子,分别进行分尚，确定复合物所在的大致位置，然后根据复合物可能存在的区间(9-18分钟)，分成10段进行收集；
[0055]3)将收集到样品进行荧光定量PCR扩增，根据扩增结果，第五管为复合物所在位置；
[0056]4)将第五管产物进行放大扩增，并纯化所得的PCR产物；[0057]5)利用凝胶阻滞实验检测蛋白和DNA的结合情况，经过一轮筛选，可以明显可以看到双链DNA与蛋白形成的复合物条带(图4第4泳道靠上的条带)。与传统的毛细管电泳方法筛选三轮的效果接近，具体结果见图4(泳道3)，其中:
[0058]a)第I泳道为分子量标准；自上至下，条带大小依次为200pb、IOObp和50bp ；
[0059]b)第2泳道为常规CE方法筛选三轮的文库分子(nP3)；
[0060]c)第3泳道为nP3中加入等分子数的靶蛋白分子；靠上的条带为复合物条带；下方的是文库分子的条带；[0061]d)第4泳道为分段收集筛选的第一轮文库分子(fPl)中加入等分子数的靶蛋白分子；靠上的条带为复合物条带；下方的是文库分子的条带；
[0062]e)第5泳道为分段收集筛选的第一轮文库分子(fPl)；
[0063]f)第6泳道为初始的文库分子，用作对照；
[0064]g)第7泳道为初始的文库分子中，加入靶蛋白分子；
[0065]实施例3、利用分段收集筛选RNA适配体
[0066]RNA适配体的筛选与实施例1类似，差异之处在于由于RNA无法直接用于DNA的扩增，所以收集到复合物后，必须先进行反转录；另一个不同之处在于，获得富集的双链DNA文库后，需要通过转录的方法获得RNA文库，具体参照QIAGEN公司提供的操作指南，得到RNA分子后，可用于亲和力的检测或进行下一轮筛选。具体步骤如下:1)RNA文库的制备合成随机的DNA文库分子，Iml PCR体系中含0.1uM的文库分子，luM3’和5’端引物，2mM MgCl2和200uM dNTP，PCR扩增5个循环(每个循环的反应条件为94°C 10s，60°C 10s,72°C 20s)；大量扩增的PCR产物经非变性PAGE胶电泳分离，GelRed染色，在凝胶成像仪中确定双链产物的位置，并切下目的条带，将凝胶切碎，用结合缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4100mMNaCl,4mM EDTA, 2mM MgC12，0.05% NP-40，0.4%核苷氧钒复合体，200U/ml Rnasin, IOOug/ml poly A, IOOug / ml tRNA)浸泡煮沸，离心，取上清；加入I % NaAc和三倍体积冰乙醇，-80°C放置4h ;于4°C 12000rpm离心5分钟，吸去上清，真空干燥并保存；
[0067]2)使用生工生物工程(上海)股份有限公司的MAXIscript T7Kit进行体外转录，RNA产量为2-6ug ;转录结束后，加入DNAase消化模板(每lug DNA加入IU DNAase)，37°C反应60min ；
[0068]3)取约lug RNA文库分子，在IOOul结合缓冲液中加入0.lug P53蛋白，置于37°C孵育I小时。将孵育后的样品利用毛细管电泳按实施例1的条件进行电泳，并收集10-22分钟之间的样品；向收集的样品管中需要加入一步法反转录试剂(QIAGEN OneStep RT-PCRKit)，从而进行Q-PCR，根据荧光定量PCR的结果确定复合物峰所在位置；
[0069]4)将复合物峰所在位置的PCR产物经过放大扩增后，按步骤(1)制备富集后的RNA文库，用于亲和力测试或进行下一轮筛选；
[0070]5)经过2轮筛选，本方法所获得的RNA文库分子的亲和力优于磁珠法8轮筛选的结果。
[0071]尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地的描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
【权利要求】
1.一种快速分离与靶分子高亲和性结合的核酸分子的方法，所述方法包括:将所述靶分子与待筛选的文库分子混合后，通过毛细管电泳或者色谱技术分离，特征是在收集复合物时分成多段进行分段收集，然后将分段收集的多份样品分别进行荧光定量PCR扩增；通过荧光定量PCR的方法确定所述靶分子与靶核酸分子所形成的复合物所在的位置，从而快速获得与靶分子高亲和性结合的靶核酸分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分段收集是分成两段以上进行收集。
3.根据权利要求1所述的方法，所选用的文库分子是单链DNA文库分子、双链DNA文库分子或RNA文库分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中当使用RNA文库进行筛选和分离时，所述方法还包括将收集到的所述靶分子与靶RNA分子所形成的复合物进行反转录的步骤，然后再通过荧光定量PCR的方法确定所述靶分子与靶RNA分子所形成的复合物所在的位置。
【文档编号】C12N15/10GK103525820SQ201310521470
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2013年10月29日 优先权日:2013年10月29日
【发明者】罗昭锋, 周宏敏, 王洁, 欧惠超, 张海燕 申请人:中国科学技术大学