一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。本发明针对TYR基因第4内含子存在7.7kb插入（ev1）设计等位基因c特异性引物P1，针对PMEL17基因第4内含子不存在7.7kb插入（ev1）设计等位基因C特异性引物P2，引物P3是引物P1和P2共同的下游引物；再以包含TYR基因的待测鸡全基因组DNA为模板，把引物P1、P2和P3放在一个PCR反应里，一次PCR反应后对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点的基因型。该方法能大大提高基因型的判定效率和准确性，且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。
【专利说明】—种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着生活水平的提高，人们的消费观念从过去的数量型转变为质量型。人们对鸡肉肉质的要求也越来越高。我国的地方鸡具有肉质好的特点，但是其生长速度较慢，饲料转化率低。而国外的快大型肉鸡虽生长速度快、饲料转化率高，其肉质较差。为解决这一问题，将国外快大型肉鸡与国内地方优质肉鸡进行杂交，既能够改善国外快大型肉鸡的肉质也能加快地方优质肉鸡的生长速度和生产性能。但是，由于我国人民长期的饮食习惯的影响，中国消费者偏爱黄麻羽、黑羽等有色羽的鸡，尤其是南方城市不接受快速生长的白羽鸡。为了使杂交后鸡的表型符合中国消费者的需求，就需要纯合的隐性白羽鸡，隐性白羽鸡生产性能高，且与我国有色羽杂交后能保持有色羽的羽色，对于我国优质鸡的育种上具有重大的意义。
[0003]络氨酸酶基因(Tyrosine，TYR)在黑色素合成过程中起到非常重要的作用。有报道称:TYR基因第4内含子是否存在7.7kb的插入，与隐性白羽相关。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物。
[0005]同时，本发明还提供一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的试剂盒。
[0006]最后，本发明还提供一种检测鸡隐性白羽位点基因型的方法。
[0007]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0008]一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物，包括引物P1、P2和P3，
[0009]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’(如 SEQ ID N0.1 所示)；
[0010]上游引物P2:5，-TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)；
[0011]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’(如 SEQ ID N0.3 所示)。
[0012]一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的试剂盒，主要包括引物P1、P2和P3，
[0013]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’ ；
[0014]上游引物P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ；
[0015]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3，。
[0016]优选的，一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的试剂盒，还包括2XTaq PCRMasterMix、灭菌超纯水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker0
[0017]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁和PCR反应缓冲液，为市售商品，可购自上海生工、大连宝生物、北京百泰克、北京康为等公司。[0018]一种检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，包括以下步骤:
[0019](I)以包含TYR基因的待测鸡全基因组DNA为模板，在同一个PCR反应体系中，利用引物P1-P3 PCR扩增鸡TYR基因C等位基因，利用引物P2-P3 PCR扩增鸡TYR基因c等位基因，得到扩增产物；
[0020]所述的引物P1、P2和P3分别为:
[0021]上游引物Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’，
[0022]上游引物P2:5 ’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3，，
[0023]下游引物P3:5 ’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3 ’ ；
[0024](2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点的基因型。
[0025]所述步骤(1)中PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH204.25 μ L, Pl 0.5 μ L, Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。
[0026]所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，57°C退火30s，72。。延伸 30s, 30 个循环；72°C延伸 IOmin ;4°C保存。
[0027]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为1%。
[0028]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为30min。电泳结束后，用凝胶成像系统对琼脂糖凝胶照相检测，判型。
[0029]所述步骤(2)中鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点基因型的方法为:CC基因型表现为267bp条带；Cc基因型表现为451bp和267bp条带；cc基因型表现为451bp。
[0030]本发明的有益效果:
[0031]本发明中用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物，是针对TYR基因第4内含子存在7.7kb插入(evl)设计等位基因c特异性引物Pl ;针对PMEL17基因第4内含子不存在
7.7kb插入(evl)设计等位基因C特异性引物P2 ;引物P3是引物Pl和P2共同的下游引物。这样引物P1-P3只能扩增c等位基因，扩增的片段大小为451bp ;引物P2-P3只能扩增C等位基因，扩增的片段大小为267bp。PCR扩增TYR基因后即可通过电泳检测分型可以准确、快速、方便的检测TYR基因隐性白羽位点基因型:CC基因型表现为267bp条带；Cc基因型表现为451bp和267bp条带；cc基因型表现为451bp。
[0032]本发明以包含TYR基因的待测鸡全基因组DNA为模板，把引物P1、P2和P3放在一个PCR反应里，一次PCR反应后再对PCR扩增片段进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点的基因型。与现有技术相比，本发明建立的分子生物学方法能大大提高基因型的判定效率和准确性，且方法简便，分型时间短，不需要测序和限制性内切酶，不需要特殊的仪器，成本低，易推广普及。
[0033]本发明通过对其他鸡群体进行判型验证了其准确性，结果表明该方法能有效地诊断隐性白羽位点的TYR基因的基因型，可以用于鸡隐性白羽位点的分子标记辅助选择，从而为缩短育种时间，加快育种进程提供有力保证。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1为本发明实施例1的技术流程示意图；
[0035]图2为实施例1中各样本TYR基因隐性白羽位点的PCR电泳图，[0036]注:编号说明如下:1、2、3、6、11、12为CC基因型，7、8、9为cc基因型，4、5、10为Ce
基因型，M为DNA Marker。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0038]实施例1
[0039]本实施例的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤:
[0040](1)样品的采集
[0041]采集河南农业大学种鸡场隐性白羽鸡品系30只，中国家禽基因库扬州隐性白羽鸡30只，卢氏绿壳蛋鸡保种厂卢氏绿壳蛋鸡30只，翅静脉采血，加1/3抗凝剂，保存于4°C冰箱保存备用。
[0042](2)基因组DNA的提取
[0043]参考文献Sambrock et al (2002)方法。
[0044](3)扩增引物
[0045]根据NCBI 公布的 TYR 基因序列(GenBank Accession NC_006088.3)设计引物 P1、P2和P3，如下所示:
[0046]上游引物P1: 5 ’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3，，
[0047]上游引物P2:5 ’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3，，
[0048]下游引物P3:5，-CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3，。
[0049](4) PCR 扩增
[0050]PCR反应体系采用混合加样法，即根据每一个反应体系所需的各种组分的数量和I次反应所需的PCR反应的个数,算出各种反应组分的总量,加入到I个1.5mL离心管中，充分混匀后瞬时离心，再分装到每个0.2mL Eppendorf PCR管中，然后分别加入模板DNA，再瞬时离心后进行PCR扩增。
[0051]PCR反应体系为:2XTaq PCR MasterMix (购自北京百泰克公司)6.25 μ L，ddH20
4.25 μ L, Pl 0.5 μ L, Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。反应程序为:95°C 预变性 5min ;95°C变性 30s，57°C退火 30s，72。。延伸 30s，30 个循环；72°C 延伸 IOmin ；
4°C保存。
[0052](5) PCR扩增产物的检测及结果判定
[0053]取8μ L PCR扩增产物，1%的琼脂糖凝胶电泳(电泳电压:120V ;电泳时间:30min)点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱参见图2。
[0054]根据电泳图谱中出现的条带的大小判定:若只有267bp的片段，则为隐性白羽纯合子；若有267bp和451bp的片段，则为隐性白羽杂合子；若只有451bp的片段，则为野生型纯合子，结果如表1所示。
[0055]表1检测验证群体检测结果统计表
[0056]
【权利要求】
1.一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的引物，其特征在于:包括引物P1、P2和P3， 上游引物 Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’ ；
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ； 下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’。
2.一种用于检测鸡隐性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:主要包括引物P1、P2和P3，
上游引物 P1: 5 ’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3，；
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’ ；
下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测 鸡隐性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:还包括 2XTaq PCR MasterMix、灭菌超纯水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和IOObp 的 DNA Marker。
4.一种检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:包括以下步骤: Cl)以包含TYR基因的待测鸡全基因组DNA为模板，在同一个PCR反应体系中，利用引物P1-P3 PCR扩增鸡TYR基因C等位基因，利用引物P2-P3 PCR扩增鸡TYR基因c等位基因，得到扩增产物； 所述的引物P1、P2和P3分别为:
上游引物 Pl:5’ -CCCAGTTCCCTTCAATTT-3’，
上游引物 P2:5’ -TGGCCGACCACTATTCCCTA-3’，
下游引物 P3:5’ -CTGATGGGCTTGCTTGAGGT-3’ ； (2)对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点的基因型。
5.根据权利要求4所述的检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(I)中 PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMix 6.25 μ L, ddH20 4.25 μ L，Pl 0.5 μ L,Ρ2 0.5 μ L, Ρ3 0.5 μ L, DNA 模板 0.5 μ L，共 12.5 μ L。
6.根据权利要求4所述的检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为:95°C预变性5min;95°C变性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s，30个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
7.根据权利要求4所述的检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为1%。
8.根据权利要求4所述的检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为30min。
9.根据权利要求4所述的检测鸡隐性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中鉴定鸡TYR基因隐性白羽位点基因型的方法为:CC基因型表现为267bp条带；Cc基因型表现为451bp和267bp条带；cc基因型表现为451bp。
【文档编号】C12N15/11GK103571963SQ201310589394
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】康相涛, 李转见, 田亚东, 韩瑞丽, 杨朋坤, 蒋瑞瑞, 吕世杰, 孙桂荣, 李国喜, 王丹丹, 王彦彬, 刘小军, 闫峰宾 申请人:河南农业大学