一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。本发明针对显性白羽野生纯合子个体在PMEL17基因第10外显子存在的一个9bp插入这一特征，设计上游引物引入PvuⅡ酶切位点，是否存在插入序列与是否存在酶切位点之间是相互对应的关系。通过对待判定基因型的鸡进行翅静脉采血，提取基因组DNA，用引物对P进行PCR扩增；然后对PCR产物进行PvuⅡ37℃酶切过夜，电泳检测酶切产物；最后根据电泳结果判定鸡显性白羽位点的基因型。与SSCP和直接测序的方法相比，本发明建立的分子生物学方法操作简单、成本低、周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。
【专利说明】—种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物、试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001]本发明具体涉及一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物，以及包含该引物的试剂盒及检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]随着城市卫生的规范管理和环境控制要求的严格，大中城市农贸市场活禽销售量将逐渐减少，白条鸡和分割鸡形式上市的肉鸡产品份额将不断增加。对于冷鲜鸡市场来说，有色羽肉鸡常因屠宰后羽毛不容易脱干净而影响屠体的美观，所以显性白羽鸡在品种的培育中具有重要意义。
[0003]白羽鸡从基因型上可以分为纯合显性白羽、杂合显性白羽和隐性白羽三种类型。我们在显性白羽鸡的育种中需要选育出纯合显性白羽基因型，来满足的育种需求。因此利用分子生物手段来诊断某个体在显性白羽位点的基因型，这对我们育种来说是非常重要和必要的。
[0004]显性白羽基因座是影响鸡羽色形成的最重要基因座位之一，其座位上的显性等位基因I会阻碍羽毛黑色 素合成，从而使携带此基因型的个体全身羽毛呈现白色。目前已确认显性白等位基因是由于PMEL17基因第10外显子9bp插入造成的。即显性等位基因I是PMEL17基因第10外显子含9bp插入基因型，隐性等位基因i是PMEL17基因第10外显子无9bp插入基因型。对于只差9bp的基因片段来说，常规PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳很难分型。近年来，人们发展了许多用于探寻分子遗传标记的方法，最常见的有单链构象多态技术(SSCP)、PCR-RFLP和直接测序技术等，但SSCP操作繁琐、耗时长，结果易造成误判；而直接测序技术成本较高。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物。
[0006]同时，本发明还提供一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的试剂盒。
[0007]最后，本发明还提供一种检测鸡显性白羽位点基因型的方法。
[0008]为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是:
[0009]一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物，包括引物对P:
[0010]上游引物P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3’ (如 SEQ ID N0.1 所示);
[0011]下游引物P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’(如 SEQ ID N0.2 所示)。
[0012]一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的试剂盒，主要包括引物对P:
[0013]上游引物P-F: 5 ’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，；
[0014]下游引物P-R : 5 ’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3，。
[0015]优选的，一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的试剂盒，还包括2XTaq PCRMasterMix、灭菌超纯水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和 IOObp 的 DNAMarker0
[0016]所述的2XTaq PCR MasterMix含有Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁和PCR反应缓冲液，为市售商品，可购自上海生工、大连宝生物、北京百泰克、北京康为等公司。
[0017]一种检测鸡显性白羽位点基因型的方法，包括以下步骤:
[0018](I)以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以引物对P为引物PCR扩增PMEL17基因第十外显子，得到扩增片段； [0019](2)对扩增片段进行Pvu II酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡显性白羽位点的基因型。
[0020]所述步骤(1)中鸡全基因组DNA采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提取。
[0021]所述步骤(1)中PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMix6.25 μ L,ddH204.25 μ L, P-F0.5 μ L, P-R0.5 μ L, DNA 模板 1.0 μ L。
[0022]所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72。。延伸 20s, 30 个循环；72°C延伸 IOmin ;4°C保存。
[0023]所述步骤(2)中Pvu II酶切反应体系为:步骤(1)的扩增片段10μ L，Bufferl.5 μ L, Pvu II 0.3 μ L, ddH203.2 μ L。
[0024]所述步骤(2)中Pvu II酶切反应条件为:37°C，酶切过夜。
[0025]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为2%。
[0026]所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为60min。
[0027]所述步骤(2)中鉴定鸡显性白羽位点基因型的方法为:11基因型表现为160bp条带；Ii基因型表现为124bp和160bp条带；ii基因型表现为124bp。
[0028]本发明的有益效果:
[0029]本发明针对显性白羽野生纯合子个体在PMEL17基因第10外显子存在的一个9bp插入这一特征，设计上游引物引入Pvu II酶切位点，是否存在插入序列与是否存在酶切位点之间是相互对应的关系。其中，引物对P是针对不含9bp插入的PMEL17基因的核苷酸序列进行设计的，引入Pvu II酶切位点后，PCR扩增产物能够被Pvu II切为124bp和27bp(27bp太短电泳时不显示)的片段(如SEQ ID N0.3所示);含9bp插入的基因序列在扩增后不存在Pvu II这一酶切位点，因此其PCR产物酶切后片段为160bp (如SEQ ID N0.4所示)。
[0030]本发明以PMELl7基因序列(GenBank Accession N0.AY636129)为模板设计引物对P。其中，在上游引物3’端引入限制性内切酶Pvu II的识别序列(见图2)。通过对待判定基因型的鸡进行翅静脉采血，提取基因组DNA，用引物对P进行PCR扩增；然后对PCR产物进行Pvu II 37°C酶切过夜，电泳检测酶切产物；最后根据电泳结果判定鸡显性白羽位点的基因型。
[0031]本发明根据PCR产物酶切后的产物的琼脂糖凝胶电泳来判定基因型。对于显性白羽位点为II基因型的个体，PCR产物酶切前后，片段为160bp ;对于显性白羽位点为Ii基因型的个体，PCR产物酶切前后，片段为160bp，124bp和27bp ;对于显性白羽位点为ii基因型的个体，PCR产物酶切前后，片段为124bp和27bp。
[0032]本发明采用琼脂糖凝胶电泳法检测PCR产物和PCR扩增后酶切产物的结果。与SSCP和直接测序的方法相比，本发明建立的分子生物学方法操作简单、成本低、周期短，大大提高了该位点基因型判定的准确性，不需要特殊的仪器，易推广普及。试验表明本方法能有效地判定显性白羽位点的基因型，可以用于鸡的显性白羽位点的分子标记辅助选择，进而建立纯合显性白羽鸡种群。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1为本发明实施例1的技术流程示意图；
[0034]图2为实施例1中用于检测9bp插入多态性的PCR引物设计和扩增产物中9bp插入位点突变的示意图；
[0035]图3为实施例1中各样本在鸡显性白羽位点的酶切电泳图，
[0036]注:编号说明如下:5，8，9为II基因型，3，6，7为Ii基因型；1，2，4为ii基因型，M 为 marker。
【具体实施方式】
[0037]下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0038]实施例1
[0039]本实施例的技术流程示意图如图1所示，主要包括以下步骤:
[0040]( I)试样的制备与保存
[0041]河南农业大学种鸡场隐性白羽鸡品系400只、淅川乌骨鸡400只、显性白羽鸡品系24只和丝羽乌骨鸡24只，中国家禽基因库扬州隐性白羽鸡30只，郑州试验站白来航鸡24只和罗曼褐壳蛋鸡CD系24只，翅静脉采血，加1/3抗凝剂，用蛋白酶K法提取血液DNA，将DNA样品保存于4°C冰箱保存备用。
[0042](2)引物设计
[0043]以PMEL17 基因序列(GenBank Accession N0.AY636129)为模板设计引物对 P，
[0044]上游引物P-F: 5，-AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，；
[0045]下游引物P-R: 5 ’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3 ’。
[0046]如图2所示，在上游引物3’端引入限制性内切酶Pvu II的识别序列，图中方框中表示插入的9bp位点，带下划线为内切酶识别序列，小写“a”是引入的错配碱基(目的为实现后续的酶切判型)。
[0047](3) PCR 扩增
[0048]以引物对P为引物，建立了 12.5μ L扩增体系:2XTaq PCR MasterMix (购自北京百泰克公司)6.25 μ L, ddH204.25 μ L, P-F0.5 μ L, P-R0.5 μ L, DNA 模板 1.0 μ L ;
[0049]反应程序为:95°C预变性5min ;95°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸20s，30个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0050](4) PCR扩增产物的酶切
[0051]15 μ L 的 Pvu II 酶切体系:将步骤(3)中的 PCR 产物 10 μ L，Bufferl.5 μ L，Pvu II 0.3 μ L，ddH203.2 μ L ;酶切反应的条件:37°C，酶切过夜。
[0052](5) PCR扩增 产物酶切后的检测与结果判定
[0053]取8 μ L PCR扩增后的酶切产物，2%的琼脂糖凝胶电泳(电泳电压:120V ；电泳时间:60min)点样，凝胶成像系统检测，电泳图谱详见图3。
[0054]根据电泳图谱中出现的条带的大小判定:若只有160bp的片段，则为显性白羽纯合子(表型为白羽)；若只有124bp的片段，则为野生型纯合子(表型为有色羽或隐性白羽)；若既有160bp又有124bp的片段，则为显性白羽杂合子(表型为白羽)。试验结果如下表1所示。
[0055]表17个不同品种的白羽鸡在显性白羽位点的判型结果
【权利要求】
1.一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的引物，其特征在于:包括引物对P:上游引物 P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，；下游引物 P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
2.一种用于检测鸡显性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:主要包括引物对P:上游引物 P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，；下游引物 P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’。
3.根据权利要求2所述的用于检测鸡显性白羽位点基因型的试剂盒，其特征在于:还包括 2XTaq PCR MasterMix、灭菌超纯水，以及包含 600bp、500bp、400bp、300bp、200bp 和IOObp 的 DNA Marker。
4.一种检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:包括以下步骤:(1)以包含PMEL17基因的待测鸡全基因组DNA为模板，以弓丨物对P为引物PCR扩增PMEL17基因第十外显子，得到扩增片段；所述的引物对P为:上游引物 P-F:5’ -AGTGGCACCACGCTCACCGTGGGGCAGCT-3，,下游引物 P-R:5’ -GAGGGGGTGAGTGCTGTGTTCTC-3’ ；(2)对扩增片段进行PvuII酶切，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据琼脂糖凝胶电泳结果鉴定鸡显性白羽位点的基因型。
5.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(I)中 PCR 扩增反应体系为:2XTaq PCR MasterMix6.25 μ L, ddH204.25 μ L，P-F0.5 μ L，P-R0.5 μ L，DNA 模板 1.0 μ L。
6.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(1)中PCR扩增反应程序为:95°C预变性5min;95°C变性30s，60。。退火30s，72。。延伸20s，30个循环；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
7.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中PvuII酶切反应体系为:步骤(1)的扩增片段10 μ L, Bufferl.5 μ L, Pvu II 0.3 μ L,ddH203.2 μ L ；Pvu II酶切反应条件为:37°C，酶切过夜。
8.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶的质量浓度为2%。
9.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中琼脂糖凝胶电泳的电压为120V，电泳时间为60min。
10.根据权利要求4所述的检测鸡显性白羽位点基因型的方法，其特征在于:所述步骤(2)中鉴定鸡显性白羽位点基因型的方法为:11基因型表现为160bp条带；Ii基因型表现为124bp和160bp条带； ii基因型表现为124bp。
【文档编号】C12Q1/68GK103602744SQ201310589406
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】康相涛, 杨朋坤, 闫峰宾, 李国喜, 田亚东, 李转见, 孙桂荣, 王彦彬, 刘小军, 吕世杰, 韩瑞丽, 蒋瑞瑞, 王丹丹 申请人:河南农业大学