一株产纤维素酶菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株产纤维素酶的菌株，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC?No.8339，类命名为：青霉菌株Penillium?piceum?H16。所述青霉菌株是将在秸秆中筛选得到的菌株Penillium?piceum?9-3为出发菌株经诱变处理后得到的。本发明将Penillium?piceum?9-3做为出发菌株诱变育种，选育得到一株产高活力纤维素酶的青霉菌株Penillium?piceum?H16，所述青霉菌株H16发酵得到的纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到7IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活力达到50IU/mL。通过将所述青霉菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纤维素酶系进行不同配比研究，得出在最优配比时大幅度高了酶活以及对微晶纤维素的水解率，降低了用酶成本。
【专利说明】一株产纤维素酶菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明微生物学领域，特别涉及一株产纤维素酶菌株及其应用。
【背景技术】
[0002]人类进入21世纪以来，在能源、资源、环境等方面面临着越来越严峻的挑战。纤维素是地球上最大的可再生性有机资源，利用这些廉价的、可再生的植物纤维素原料来生产生物基产品以及生物质能，对人类的可持续发展是非常有利的。纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50%以上。在我国， 每年有数亿吨的农作物秸杆被焚烧掉，既污染了环境又浪费了资源。目前纤维素糖化的方法主要有酸解法和酶解法，但酸解法有耗能大、对设备损耗大、污染大等缺点，因此酶解法将是纤维素酶糖化的主要趋势。但由于纤维素酶的生产成本过高，导致木质纤维素降解成本过高，使得无法真正实现工业化。因此，为了提高酶水解效率，降低工业生产中纤维素酶的成本，世界各国科学家围绕纤维素酶展开了广泛的研究，包括菌株的筛选、发酵工艺的优化等等。
[0003]纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、 外切葡聚糖酶和3 -葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。
[0004]目前，纤维素酶的生产方法一般是固态发酵和液态发酵。固态发酵成本低，但易污染杂菌，不易提取，难以进行大规模工业化生产。而液态发酵，属于密闭式发酵，发酵过程中不易污染，且发酵条件以控制，后期分离提取酶液简便，因此便于大规模生产。生产高活性的纤维素酶除具有优良的发酵工艺路线，包括培养基、发酵时间、发酵温度等，最关键的因素是选育高产菌株。
[0005]纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前研究较多的菌包括木霉、曲霉等，例如里氏木霉、黑曲霉，尤以木霉属最为受关注，而对青霉属的报道较少。本发明所表述的即为一株高产纤维素酶的青霉属菌株。
【发明内容】
[0006]本发明目的在于提供一株产纤维素酶菌株。本发明是利用诱变方法对出发菌株进行诱变筛选出更高产的纤维素酶菌株，并且所述纤维素酶的酶活力得到了很大提高。本发明对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了用酶成本。
[0007]为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为:
[0008]一株产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8339，分类命名为:青霉菌株Penillium piceum H16。[0009]本发明的青霉菌株Penillium piceum H16的形态学特征为:
[0010]本发明的桧状青霉H16的形态学特征为:菌株H16在PDA培养基上30°C恒温培养 2d即可看到清晰的白色菌落，菌落开展，绒状，4~5d时表层着生一层墨绿色分生孢子粉， 菌株生长后期背面观察呈黄色。孢子的颜色较出发菌株Penillium piceum 9-3相比要深， 出发菌株为黄绿色，H16的孢子为墨绿色。
[0011]所述青霉菌株H16是将菌株Penillium piceum 9_3经诱变方法处理后筛选得到的。
[0012]所述诱变筛选方法包括以下步骤:
[0013]I)在所述菌株Penillium piceum 9_3的孢子悬液中添加硫酸二乙酯,所述硫酸二乙酯添加量为使所述孢子悬液中硫酸二乙酯的质量百分比浓度为1%，之后在10~ 30°C, 50~150rpm震荡反应10~120min，获得所述孢子悬液的诱变处理液，备用；
[0014]2)以所述反应时间为准，每间隔IOmin按体积比为1: 9取出诱变处理液与浓度为25%的硫代硫酸钠溶液进行混合，获得诱变终止液并根据时间顺序编号；
[0015]3)将编号的所述诱变终止液按顺序分别涂布PDA平板，25~33 °C培养直至长出单菌落；
[0016]4)将所述单菌落通过对比在刚果红平板上透明圈与菌落直径之比的大小和发酵培养测定粗酶液酶活力的方法筛选得到所述青霉菌株H16。
[0017]所述步骤I)所述反应时间为60min。
[0018]所述青霉菌株H16应用于生产纤维素酶。
[0019]—株应用权利要求1~5所述产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法,其特征在于,用于培养所述产纤维素酶菌株的培养基的组分含量为:微晶纤维素10~30g/L，葡萄糖I~ 10g/L,玉米衆干粉10~20g/L,硫酸铵I~10g/L,磷酸二氢钾I~10g/L,硫酸镁I~IOg/ L以及加水至1L。
[0020]优选的是，所述培养条件为:温度为26~32°C，转速为150~250rpm震荡培养， 初始PH为5.0~6.0，接种量为I~5%，发酵培养时间为96~144h。
[0021]优选的是，所述培养条件为:初始pH为5.5，发酵培养时间为120h。
[0022]本发明的有益效果是本发明将Penillium piceum 9_3做为出发菌株诱变育种,选育得到一株产高活力纤维素酶的青霉菌株，所述菌株发酵得到的纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到7IU/mL，^ -葡萄糖苷酶酶活力达到50IU/mL。通过将所述菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纤维素酶系进行不同配比研究，得出在最优配比时大幅度高了酶活以及对微晶纤维素的水解率，降低了用酶成本。本发明对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了用酶成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0023]图1为本发明所述产纤维素酶菌株诱变筛选方法流程图。
[0024]图2为本发明所述产纤维素酶菌株发酵所得粗酶液与里氏木霉RUT-C30的粗酶液按照不同体积比例配比所得混合酶液的滤纸酶活力比较图。
[0025]图3为本发明所述产纤维素酶菌株和里氏木霉RUT-C30的混合酶提取液与里氏木霉酶RUT-C30提取液的水解率的比较图。【具体实施方式】
[0026]下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0027]实施例1:出发菌株的培养
[0028]将桧状青霉菌株9-3在PDA斜面上连续活化两次，在30°C恒温箱中培养3_4天，之后，4 C保存备用。
[0029]桧状青霉9-3 (Penicillium piceum 9-3) 0保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期:2011年10月9日，保藏号:CGMCC5314。
[0030]实施例2:硫酸二乙酯诱变筛选菌株H16 (如图1所示)
[0031]I)硫酸二乙酯诱变
[0032]用pH为7的磷酸缓冲液洗下PDA斜面培养的孢子，无菌玻璃珠打散，两层无菌擦镜纸过滤，得孢子悬液，血球计数板计数，调整孢子浓度为IO6个/mL，取4mL孢子悬液，加入到16mL的pH为7的磷酸缓冲液中，再添加0.2mL硫酸二乙酯,在30°C, 150r/min条件下反应开始20min后每隔5min取反应液0.1mL加入到0.9mL的浓度为25%的硫代硫酸钠中充分混合，终止诱变反应，然后将混合液稀释三个梯度使混合液中菌种终浓度为IO5个/mL、 IO4个/mL、IO3个/mL，分别取三种浓度的稀释液0.1mL涂布PDA平板，30°C培养直至长出单菌落，用于检测诱变的致死率和正突变率。如表1所示，55min时致死率)和正突变率 (% )几乎达到100%。
[0033]2)筛选
[0034]①刚果红染色筛选:在上述平板上选取不同处理时问、不同形态的菌落100株，接种到含有蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L，羧甲基纤维素钠10g/L，磷酸二氢钾Ig/ L，琼脂18g/L，吐温-80 2mL/L。30°C培养4_5天后，用浓度为I %的刚果红染色lh。在上述平板上选取透明圈与菌落直径比值较大的菌落9个，接种到PDA斜面，30°C培养4-5天后保存菌种。
[0035]②发酵培养筛选:将上述保存的菌株接种到种子培养基中增值培养，然后接入到发酵培养基进行诱导产酶，并对离心获得粗酶液进行酶活测定，经过对比筛选得到I株酶活较高的菌株。
[0036]所述的种子培养基为:微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L。
[0037]所述的发酵培养基为:微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，碳酸钙
2.5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁lg/L。在30°C，200转/min，初始pH5.5，接种量3%，发酵培养120h。
[0038]
【权利要求】
1.一株产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为=CGMCC N0.8339，分类命名为:青霉菌株Penillium piceum H16。
2.如权利要求1所述产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H16是将菌株 Penillium piceum 9_3经诱变方法处理后筛选得到的。
3.—株如权利要求2所述的产纤维素酶菌株的诱变筛选方法，其特征在于，向所述菌株Penillium piceum 9-3的孢子悬液中添加硫酸二乙酯进行10~120min诱变反应。
4.如权利要求3所述产纤维素酶的诱变筛选方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)在所述菌株Penilliumpiceum 9_3的所述孢子悬液中添加硫酸二乙酯,所述硫酸二乙酷添加量为使所述抱子悬液中硫Ife二乙酷的质量百分比浓度为0.8~1.2 ,之后在 10~30°C，50~150rpm震荡反应10~120min，获得所述孢子悬液的诱变处理液，备用；2)以所述反应时间为准，每间隔8~12min取出0.1~0.3mL诱变处理液与硫代硫酸钠溶液进行混合中和所述诱变处理液中的硫酸二乙酯以终止诱变反应，获得诱变终止液并根据时间顺序编号；3)将编号的所述诱变终止液按顺序分别涂布PDA平板，25~33°C培养直至长出单菌落；4)将所述单菌落通过对比在刚果红平板上透明圈与菌落直径之比的大小和发酵培养测定粗酶液酶活力的方法筛选得到所述青霉菌株H16。
5.如权利要求3所述产纤维素酶的菌株的诱变筛选方法，其特征在于，所述步骤I)所述硫酸二乙酯的质量百分比浓度为1%，反应时间为60min。
6.如权利要求2所述产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述青霉菌株H16应用于生产纤维素酶。
7.—株应用权利要求3~5中任一项所述的产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法,其特征在于，用于培养所述产纤维素酶菌株的培养基的组分含量为:微晶纤维素10~30g/L，葡萄糖I~10g/L，玉米浆干粉10~20g/L，硫酸铵I~10g/L，磷酸二氢钾I~10g/L，硫酸镁I~10g/L以及加水至1L。
8.如权利要求7所述产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养条件为:温度为26~32°C，转速为150~250rpm震荡培养，初始pH为5.0~6.0，接种量为I~ 5%，发酵培养时间为96~144h。
9.如权利要求8所述产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养条件为:初始PH为5.5，发酵培养时间为120h。
【文档编号】C12N15/01GK103555595SQ201310589231
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】陈树林, 张粲, 宗志友, 贾文娣, 赫荣琳, 武改红, 李晨, 张东远 申请人:中国科学院天津工业生物技术研究所