一种用于分子标记辅助育种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法，该方法包括：（1）将待测棉花植株的种子用浸种液浸泡；（2）将浸泡后的种子种植于病圃中；（3）选择能够在病圃中存活的棉花植株作为初筛棉花植株；（4）分别使用第一引物对和第二引物对初筛棉花植株的基因组DNA进行PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；第一引物对如SEQ?ID?NO:1和SEQ?ID?NO:2所示，第二引物对如SEQ?ID?NO:3和SEQ?ID?NO:4所示；如果第一扩增产物中具有SEQ?ID?NO:5所示的核酸且第二扩增产物中具有SEQ?ID?NO:6所示的核酸，则指示待测棉花植株为抗黄萎病植株。本发明对黄萎病菌的抗性进行预测和筛选，淘汰病圃筛选过程中虽不发病但仍为感病的植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率。
【专利说明】一种用于分子标记辅助育种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及农业生物【技术领域】，具体地，涉及一种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法。
【背景技术】
[0002]棉花黄萎病是世界性的重大植物病害，常年给棉花生产造成10-15%的产量损失，严重年份超过全国植棉面积的60%，给棉花生产造成沉重打击。其病原菌随种子、残枝败叶和土壤传播，菌核在土壤中可存活多年，化学药物、耕作栽培等手段对其无效，被植物病理界称为棉花的“癌症”，成为长期以来悬而未决的世界性难题。培育抗病品种被公认为是解决棉花黄萎病最经济有效的手段，究其一直未能成功的原因是棉花黄萎病的抗性受多个主效基因共同控制的多基因控制遗传模式，遗传机制较为复杂(祁伟彦，张永军，张天真，陈捷胤，戴小枫.基于人工病圃筛选和分子标记辅助的棉花抗黄萎病育种方法研究与应用.分子植物育种，2012，10(5):607-612;蒋锋，赵君，周雷，郭旺珍， 张天真.陆地棉抗黄萎病基因的分子标记定位.中国科学，2009，39(9):849-861;葛海燕，汪业春，郭旺珍，张天真.陆地棉抗黄萎病性状的遗传及分子标记研究.棉花学报，2008, 20(I):19-22;Jiang F，Zhao J, Zhou L, Guo WZ, Zhang TZ.Molecular mapping of Verticillium wilt resistance QTL on chromosomes D7and D9in upland cotton.Science China SerC-Life Science, 2009，52 (9):872-884;杨扼，郭旺珍，张天真?陆地棉抗黄萎病、纤维品质和产量等农艺性状的QTL定位.分子植物育种，2007,5(6):797-805)， 缺乏有效的可用于稳定筛选和准确跟踪其抗性基因的分子标记，鉴定十分困难，导致棉花抗黄萎病育种进展缓慢。 [0003]早在20世纪40年代我国就开始棉花育种，50年代后开展杂交育种，当时棉田病害轻，基本上根据产量表现选育品种。70年代后棉花枯萎病的发生逐渐加重，开始了抗枯萎病育种，但育种技术基本上采用自然感病试验田进行抗病性鉴定，由于病原菌不足，田间发病不均匀，年份间差异大，育种亲本和杂交后代材料鉴定结果不准确，材料当选或淘汰盲目性较大。90年代后黄萎病发生渐趋严重，迫切需要培育抗黄萎病品种，但抗病性鉴定与选育仍然采用与抗枯萎病类似的方法，育种效率低，后代材料选择不准确，育成品种抗病性差，且抗病品种产量较低。
[0004]棉花抗黄萎病分子标记辅助育种技术已经在纤维品种改良、不育系改良等得到应用，但在抗黄萎病品种选育上由于缺乏稳定可靠、紧密连锁的分子标记，尚未应用与生产实际。雷蒙德氏棉是对黄萎病高抗的野生棉种，也是栽培棉种陆地棉和海岛棉的D染色体组的共同祖先，通过对雷蒙德氏棉基因组抗病基因的分析及其SSR标记的系统开发，可以获得在栽培棉种中稳定遗传的抗黄萎病基因簇及其连锁的SSR标记，进而对棉花育种过程中不同的材料、品系、品种进行早期世代筛选，淘汰不抗病的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率，由此建立高效准确的棉花抗黄萎病选育技术。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种检测棉花植株对黄萎病菌抗性的方法。
[0006]为了实现上述目的，本发明提供了一种检测棉花植株对黄萎病菌抗性的方法，该方法包括:
[0007](I)将待测棉花植株的种子用浸种液浸泡；所述浸种液是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎，用水浸泡，过滤得到的菌悬液；
[0008](2)将浸泡后的种子种植于病圃中；所述病圃是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎掺入土壤之后构建的；
[0009](3)选择能够在病圃中存活的棉花植株作为初筛棉花植株；
[0010](4)分别使用第一引物对和第二引物对初筛棉花植株的基因组DNA进行PCR扩增， 得到第一扩增产物和第二扩增产物；第一引物对如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物对如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；
[0011]如果第一扩增产物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二扩增产物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，则指示待测棉花植株为抗黄萎病植株。
[0012]通过上述技术方案，本发明能够实现对棉花植株对黄萎病菌抗性进行方便、快速地检测。
[0013]本发明的其他 特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0015]图1是品种名称海岛棉7124和军棉I号的棉花植株的第一扩增产物电泳图。
[0016]图2是品种名称海岛棉7124和军棉I号的棉花植株的第二扩增产物电泳图。
[0017]图3是12个初筛棉花植株的第一扩增产物电泳图。
[0018]图4是12个初筛棉花植株的第二扩增产物电泳图。
【具体实施方式】
[0019]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0020]本发明提供了一种检测棉花植株对黄萎病菌抗性的方法，该方法包括:
[0021](I)将待测棉花植株的种子用浸种液浸泡；所述浸种液是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎，用水浸泡，过滤得到的菌悬液；
[0022](2)将浸泡后的种子种植于病圃中；所述病圃是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎掺入土壤之后构建的；
[0023](3)选择能够在病圃中存活的棉花植株作为初筛棉花植株；
[0024](4)分别使用第一引物对和第二引物对初筛棉花植株的基因组DNA进行PCR扩增， 得到第一扩增产物和第二扩增产物；第一引物对如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物对如SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示；[0025]如果第一扩增产物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二扩增产物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，则指示待测棉花植株为抗黄萎病植株。
[0026]其中，如果第一扩增产物中不具有SEQ ID NO: 5所示的核酸或者第二扩增产物中不具有SEQ ID N0:6所示的核酸，则指示待测棉花植株为感黄萎病植株。
[0027]其中，所述PCR扩增的条件可以包括:变性温度为93.5-94.5°C ;退火温度为 54.5-55.5。。。
[0028]其中，所述PCR扩增的条件还可以包括:PCR循环数为28-32轮。
[0029]其中，制备浸种液时，相对于每重量份的死于黄萎病的棉花植株的组织，水的用量可以为5重量份。
[0030]其中，用浸种液浸泡种子时，相对于每重量份的种子，浸种液的用量可以为2重量份。
[0031]其中，用浸种液浸泡种子的时间可以为6小时。
[0032]其中，构建病圃时，相对于每平方米的土壤，死于黄萎病的棉花植株的组织的掺入量可以为3kg。
[0033]其中，待测棉花植株的基因组DNA可以通过常规的DNA提取方法从待测棉花植株中提取得到。
[0034]本发明可通过检测分子标记对棉花植株对黄萎病菌的抗性进行预测和筛选，淘汰病圃筛选过程中虽不发病但仍为感病的植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率。
[0035]以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0036]实施例1
[0037]I)收集31种棉种材`料，按照文献(张兴华，棉花抗枯、黄萎病研究进展及其抗性鉴定方法，江西农业学报，2008，20(3):43-49)中的人工苗床病圃法，鉴定它们的抗病性，结果如表1中所列，其中，抗病种质3份，在表1的抗黄萎病材料一栏表示为“R”；感病种质28 份，在表1的感黄萎病材料一栏表不为“S”。
[0038](2)按照《分子克隆实验指南》中的方法，分离每份种质的基因组DNA。
[0039]以每份种质的基因组DNA为模板，采用正向引物如SEQ ID NO:1所示(5' -AAACAA TMTAAACGAGTTGAATTA-3')且反向引物如SEQ ID NO:2所示(5' -TTGTTTCATAATTTTAAAGTA TGTA-3')的第一引物对进行PCR扩增，变性温度为94°C ;退火温度为55°C:PCR循环数为 30轮；分别得到每份材料的第一扩增产物。
[0040]以每份种质的基因组DNA为模板，采用正向引物如SEQ ID N0:3所示(5' -AAGGGT AAGTAATAAATCATAGMC-3')且反向引物如SEQ ID N0:4所示(5' -GCATTTATCCATTTCTTTACT TTTC-3')的第二引物对进行PCR扩增，变性温度为94°C ;退火温度为55°C:PCR循环数为 30轮；分别得到每份材料的第二扩增产物。
[0041](3)按照《分子克隆实验指南》中的方法，将步骤(2)中的第一扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测；图1是品种名称海岛棉7124和军棉I号的棉花植株的第一扩增产物电泳图；与海岛棉7124带型一致的在表1的分子标记检测结果一栏中表示为“ + ” ；与军棉I号带型一致的在表1的分子标记检测结果一栏中表示为在海岛棉7124的电泳图中(图1左泳道)，自上而下第3条带的大小为185bp，经测序的序列为SEQ ID NO: 5(AAAC AATMTAAACGAGTTGAATTAAAATGCTTTTGTAATTAMTGGGCATAAAAAGATAGACATTTTGCGAATCAACAAGACCATAAAATATATGAMATTTTMTATATATATATATGTATGTGTATGTACATAAAATATGAAAMAATATGTAGGTA TACATACTTTAAAATTATGAAACAA)，是相对于军棉I号的差异条带。
[0042]按照《分子克隆实验指南》中的方法，将步骤(2)中的第二扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳检测；图2是品种名称海岛棉7124和军棉I号的棉花植株的第二扩增产物电泳图；与海岛棉7124带型一致的在表1的分子标记检测结果一栏中表示为“ + ” ；与军棉 I号带型一致的在表1的分子标记检测结果一栏中表示为在海岛棉7124的电泳图中 (图2左泳道)，自上而下第I条带的大小为249bp，经测序的序列为SEQ ID N0:6(5’_AAGGG TAAGTAATAMTCATAGAACACAATAATAATGACGTAATTATAATAATAATCACCAAATAATAATAACAATGACCATA TTAATTACTATTCTAATACTAAAAATATAAAAATGAATTMACACTMTAAAAATGATAATAATAAAATAATAATAAT AGTGATAATAATAATGAAATGTATAAATAAAGGAATAAATAACAATATAAATTCTAAACACAAGAAAAGTAAAGAAA TGGATAAATGC-3’)，是相对于军棉I号的差异条带。
[0043]表1
[0044]
【权利要求】
1.一种检测棉花植株对黄萎病抗性的方法，其特征在于，该方法包括:(1)将待测棉花植株的种子用浸种液浸泡；所述浸种液是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎，用水浸泡，过滤得到的菌悬液；(2)将浸泡后的种子种植于病圃中；所述病圃是将死于黄萎病的棉花植株的组织粉碎掺入土壤之后构建的；(3)选择能够在病圃中存活的棉花植株作为初筛棉花植株；(4)分别使用第一引物对和第二引物对初筛棉花植株的基因组DNA进行PCR扩增，得到第一扩增产物和第二扩增产物；第一引物对如SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2所示，第二引物对如 SEQ ID NO: 3 和 SEQ ID NO:4 所示；如果第一扩增产物中具有SEQ ID N0:5所示的核酸且第二扩增产物中具有SEQ ID NO:6所示的核酸，则指示待测棉花植株为抗黄萎病植株。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述PCR扩增的条件包括:变性温度为 93.5-94.50C ;退火温度为 54.5-55.5°C。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述PCR扩增的条件还包括:PCR循环数为28-32轮。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，制备浸种液时，相对于每重量份的死于黄萎病的棉花植株的组织，水的用量为5重量份。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，用浸种液浸泡种子时，相对于每重量份的种子，浸种液的用量为2重量份。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，用浸种液浸泡种子的时间为6小时。
7.根据权利要求 1所述的方法，其中，构建病圃时，相对于每平方米的土壤，死于黄萎病的棉花植株的组织的掺入量为3kg。
【文档编号】C12Q1/68GK103602743SQ201310588981
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月20日 优先权日:2013年11月20日
【发明者】戴小枫, 陈捷胤, 李蕾, 马雪峰, 桂月晶, 孔志强, 包郁明 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所