草莓斑驳病毒的快速检测试剂盒及方法
【专利摘要】本发明公开了检测草莓斑驳病毒（Strawberry?mottle?virus）的专用引物及其应用。检测草莓斑驳病毒（Strawberry?mottle?virus）的专用引物，由序列表的序列1所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。利用本发明引物进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
【专利说明】草莓斑驳病毒的快速检测试剂盒及方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及草莓斑驳病毒的RT-LAMP检测引物组、检测试剂盒及方法。。
【背景技术】
[0002]草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus, SMoV)是温州蜜柑萎缩病毒属(Sadwavirus)病毒，目前在草莓栽培区广泛分布。为正义ssRNA病毒，RNAl长7036bp、RNA2长5619bp。病毒粒体等大，无包膜，粒体直径约37nm。侵染植株后会存在于叶片、表皮、韧皮部、细胞质中。该病毒主要通过蚜虫半持久性在草莓植株间传播。感染病毒的草莓植株主要症状为:叶脉透明、脉序混乱，叶片褪绿斑驳，植株矮化。症状在不同的季节而有所不同或隐症，但生长势衰弱，产量降低。该病毒存在广泛的株系分化现象，主要有草莓顶端串生株系(Strawberry crown prdiferation)、卷缩斑马支株系(Strawberry curly mottle virus)、轻型斑驳株系(Strawberry mild mottle virus)、重型斑驳株系(Strawberry severe mottlevirus)、镑叶斑驳株系(Strawberry rusly leaf virus)及 I 号类型株系(Strawberrytypelvirus)0
[0003]由于草莓斑驳蚜虫传播等原因，病毒病害防治困难，因此，建立高效灵敏的检测技术，成为解决种苗检测、早期鉴定等问题的关键，为草莓栽培提供保障。草莓斑驳病毒的检测技术目前包括指示植物的小叶嫁接法、血清学方法和反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)等。小叶嫁接法、血清学方法周期长、灵敏度较低、较为费时费工，反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测病毒灵敏度高，但需要特殊的仪器和试剂，在农业生产单位和技术推广部门很难应用检测。
[0004]逆转录环介导等温扩增技术检测病毒操作简便，不需要特殊的仪器和试剂，操作简单，可以在恒温条件下快速检测，不需要长时间的温度循环，不需要昂贵的PCR仪，尤其是反转录和扩增反应都能在恒定温度下同时进行，大大的降低了检测时间，并且成本较低。反应完成后，通过荧光染色可以直接观察，也减少了时间，不需要电泳和紫外成像观察检测结果。逆转录环介导等温扩增技术与其他病毒检测方法相比，快速、简便、灵敏，目前尚未有将逆转录环介导等温扩增技术在草莓斑驳病毒检测上的应用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的专用引物以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的草莓斑驳病毒(Strawberry mottlevirus)的快速分子检测方法。
[0006]本发明所提供的检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的专用引物，由序列表的序列I所示DNA、序列表的序列2所示DNA、序列表的序列3所示DNA和序列表的序列4所示DNA组成。
[0007]本发明还提供一种检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的试剂盒,包括所述的专用引物。[0008]本发明所述专用引物在制备检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的试剂盒中的应用也属于本发明的保护范围
[0009]上述专用引物或试剂盒在鉴定草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病毒病中的应用也是本发明的保护范围。
[0010]本发明还保护一种检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)或检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病害发生危害的方法,包括如下步骤:
[0011](I)提取待测生物样本的基因组RNA ；
[0012](2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增；
[0013](3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)或者是否感染草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病害。[0014]所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为:62°C 45分钟，80°C 10分钟。
[0015]所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所不DNA的浓度均为1.0 μ M,序列表的序列2所不DNA和序列表的序列3所不DNA的浓度均为0.1 μ Μ。
[0016]所述逆转录环介导恒温扩增的体系包括:1.ΟμΜ SMoV-FIP,1.0uM SMoV-BIP，
0-ΙμΜ SMoV-F3，0.ΙμΜ SMoV_B3，IOXBst buffer, 2mM MgSO4,1.2mM dNTPs, IMBetaine，2mM DTT，5U AMV Reverse Transcriptase,25U RNase Inhibitor，8U Bst DNApolymerase，DEPC ddH20，待测生物样本的基因组RNA，扩增体系总体积为25 μ I。
[0017]所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法为下述I)或2)所述的方法:
[0018]I)扩增产物中加入0.1 μ I荧光染料SYBR green I，肉眼直接观察，染有草莓斑驳病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓斑驳病毒侵染的样本透明并呈橘红色；
[0019]2 )常规电泳和紫外成像方法，感染有草莓斑驳病毒的样本能形成瀑布型条带。
[0020]本发明基于逆转录环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)的草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)检测试剂盒及方法,该试剂盒根据草莓斑驳病毒的基因保守区域设计了四个特异性引物，可以特异性的检测样品中草莓斑驳病毒。利用本发明试剂盒进行检测，检测过程快速、灵敏、操作简便，不需要其他贵重仪器和试剂，特别适合种苗繁育、脱毒培养、田间调查时快速检测和生产基层技术人员掌握应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0021 ] 图1为SMoV RT-LAMP各反应温度扩增产物电泳检测；图1中，泳道M.DNAMarkerAL2000 ;泳道 1:60°C ;泳道 2:61°C ;泳道 3:62°C ;泳道 4:63°C ;泳道 5:64°C ;泳道 6:65°C。
[0022]图2为SMoV RT-LAMP不同反应时间扩增产物电泳检测；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 I:30min ;泳道 2:45min ;泳道 3:60min ;泳道 4:75min。
[0023]图3为SMoV RT-LAMP引物FIP/BIP不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M.DNA Marker AL2000 ;泳道1:1.ΟμΜ;泳道 2:1.2μΜ;泳道 3:1.4μΜ;泳道 4:1.6μΜ;泳道 5:1.8μΜ。[0024]图4为SMoV RT-LAMP引物F3/B3不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M:DNAMarker AL2000 ;泳道1:0.ΙμΜ;泳道 2:0.15 μ Μ;泳道 3:0.2μ Μ;泳道 4:0.25 μ Μ;泳道 5:
0.3 μ Μ。
[0025]图5为SMoV RT-LAMP Mg2+不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 1:2mM ;泳道 2:4mM ;泳道 3:6mM ;泳道 4:8mM ；5:10mM。
[0026]图6为SMoV RT-LAMP dNTPs不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M:DNAMarker AL2000 ;泳道1:0.2mM ;泳道2:0.4mM ;泳道3.0.8mM ;泳道4:1.2mM ;泳道5:1.6mM ；泳道 6:2.0mM。
[0027]图7为SMoV RT-LAMP betaine不同终浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M =DNAMarker AL2000 ;泳道 1:0.2M ;泳道2:0.4M ;泳道3:0.8M ;泳道4:1.0M ;泳道5:1.2M ;泳道
6:1.4M。
[0028]图8为SMoV RT-LAMP DTT浓度扩增产物电泳检测；其中，泳道M =DNAMarkerAL2000 ;泳道 I:2.0mM ;泳道 2:2.4mM ;泳道 3:2.8mM ;泳道 4:3.2mM ;泳道 5:3.6mM ；泳道 6:4.0mM。
[0029]图9为SMoV RT-PCR灵敏度测定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10—1、10_2、10_3、10_4、10_5、10_6和10'
[0030]图10为SMoV RT-LAMP灵敏度测定；其中，泳道M:DNA Marker AL2000 ;泳道1:提取的RNA原液做模板；泳道2-8依次为RNA原液稀释10—1、10_2、10'10_4、10_5、10_6和10'[0031 ] 图11为SMoV RT-LAMP的特异性测定；其中，(a )为LAMP产物的电泳和凝胶成像技术检测；(b)为LAMP产物加入SYBR green I检测；泳道M:DNA MarkerAL2000 ;泳道1:健康植株样品RNA ;泳道2-5依次为含有SVBV的植株样品RNA和含SMoV，SVBV, SMYEV和SCV的植株样品RNA。
【具体实施方式】
[0032]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂公司购买得到的。
[0033]实施例1、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)逆转录环介导引物及其应用
[0034]一、草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)逆转录环介导引物的获得
[0035]根据美国NCBI中的GenBank发布的草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)RNA2 的 cDNA 序列(AJ311876，AJ496586, AJ496590, AM396561, AY919307, EU440731 和JN388392 )，通过软件DNAMAN 7.0进行同源性分析后找出草莓斑驳病毒(Strawberrymottle virus) RNA2的3,端非编码区的保守序列作为模板,使用在线软件Primer3 Input(http://bioinf0.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)设计 RT-LAMP 引物，并对设计的引物进行筛选，序列调整，验证，最终获得一组敏感性和特异性很高的LAMP引物。引物由上海生工生物技术有限公司合成，引物序列如下表1 ;
[0036]表1 SMoV RT-LAMP检测引物组
[0037]·
【权利要求】
1.检测草莓斑驳病毒(Strawberrymottle virus)的专用引物，由序列表的序列I所7]n DNA、序列表的序列2所不DNA、序列表的序列3所不DNA和序列表的序列4所不DNA组成。
2.—种检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)的试剂盒,包括权利要求1所述的专用引物。
3.权利要求1所述专用引物在制备检测草莓斑驳病毒(Strawberrymottle virus)的试剂盒中的应用。
4.权利要求1所述专用引物或权利要求2所述试剂盒在鉴定草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病毒病中的应用。
5.一种检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)或检测草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病毒病感染的方法,包括如下步骤: (1)提取待测生物样本的基因组RNA； (2)以步骤(1)的基因组RNA为模板，用权利要求1所述的专用引物进行逆转录环介导恒温扩增； (3)根据步骤(2)的扩增产物鉴定所述待测生物样本是否含有草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)或者是否感染草莓斑驳病毒(Strawberry mottle virus)病害。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增的反应程序为:620C 45 分钟，80°C 10 分`钟。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增的反应体系中，序列表的序列I所示DNA和序列表的序列4所示DNA的浓度均为1.0 μ M，序列表的序列2所示DNA和序列表的序列3所示DNA的浓度均为0.1 μ Μ。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于:所述环介导恒温扩增的体系包括:1.0μ MSMoV-FIP,1.Ομ M SMoV-ΒΙΡ,Ο.1 μ M SMoV_F3，0.1 μ M SMoV_B3，10XBst buffer,2mMMgSO4,1.2mM dNTPs,IM Betaine,2mM DTT,5U AMV Reverse Transcriptase,25U RNaseInhibitor, 8U Bst DNA polymerase, DEPC ddH20,扩增体系总体积为 25 μ I ?
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述逆转录环介导恒温扩增产物的检测方法为下述I)或2)所述的方法: I)扩增产物中加入0.1 μ I荧光染料SYBR green I，肉眼直接观察，染有草莓斑驳病毒的样本会有沉淀物形成并呈现黄绿色，无草莓斑驳病毒侵染的样本透明并呈橘红色； 2)常规电泳和紫外成像方法，感染有草莓斑驳病毒的样本能形成瀑布型条带。
【文档编号】C12N15/11GK103667526SQ201310613504
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月27日 优先权日:2013年11月27日
【发明者】尚巧霞, 陈柳, 魏艳敏, 陈笑瑜, 邢冬梅, 刘正坪, 赵晓燕, 冉策, 杨建强, 胡学军, 陈明远, 祝宁, 韩成贵 申请人:北京农学院