一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法，包括以生物信息学软件预测hCE1蛋白最佳抗原表位区的分布；用PCR技术扩增含hCE1蛋白最佳抗原表位区的基因截短片段；将得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCE1基因原核表达重组质粒；将构建的hCE1基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；培养转化的宿主细胞，以表达重组hCE1蛋白；分离、纯化重组hCE1蛋白。采用本发明方法，达到了理想的蛋白纯度和产量，为后期制备优质的抗hCE1多克隆抗体、抗hCE1单克隆抗体及高特异性的hCE1ELISA试剂盒等研究工作提供了物质基础。
【专利说明】一种重组hCE1蛋白的可溶性表达和纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物基因工程领域中重组人基因的可溶性表达和纯化方法，特别涉及到重组人羧酸酯酶I (hCEl)基因的可溶性表达和纯化。
【背景技术】
[0002]人羧酸酯酶I (human carboxylesterase 1，hCEl)主要由肝脏合成,亦被称为肝羧酸酯酶，是丝氨酸水解酶超家族的重要成员之一，在肝脏的药物水解代谢功能方面发挥着重要作用。该酶能有效地催化含酯键、硫酯键、酰胺键基团的多种药物或前体药物的水解代谢，并与多种药物、环境毒物及致癌物的解毒和代谢有关。hCEl还参与体内脂肪酸、胆固醇酯的运输和代谢，能催化内源性化合物的水解，可保护机体中枢神经系统免受酯类、酰胺类化合物的损伤，是人血脑屏障系统的重要组成部分。
[0003]肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是一种严重危害人类健康的恶性肿瘤，其恶性程度高、进展较快、预后差，且目前HCC患者漏诊率较高。研究表明，HCC患者血浆中hCEl含量显著升高，可作为HCC早期诊断的一种良好的血清学标志物。hCEl是一种N-糖基化蛋白，含有内质网滞留信号肽，它可通过高尔基体从肝脏分泌到血浆中。在HCC发生发展过程中，癌细胞的增长可大量激活hCEIN-糖基化，使其分泌到血浆中的量急剧增加。Paik等报道，HCC患者血浆中hCEl的含量是正常人血浆hCEl含量的2_5倍(Paik YK, SeoulKN.Plasma biomarker tool for the diagnosis of liver cancer comprising livercarboxylesterase I and liver cancer screening methodl2/994406.04/28/2011.)。Na等证实了 HCC患者血浆中hCEl的含量显著高于慢性肝炎、胃癌、胰腺癌患者及健康志愿者，且hCEl诊断HCC的灵敏度及特异度分别可达到70.8%、92.3% (Na K, Lee EY, Lee HJ, etal.Human plasma carboxylesterase 1，a novel serologic biomarker candidate forhepatocellular carcinoma.Proteomicsj 2009，9 (16): 3989-3999.)。若将 hCEl 联合目前诊断HCC灵敏度已达到60%-70%的甲胎蛋白(alpha-fetopiOtein，AFP)指标，HCC阳性患者的诊断率将进一步提高，可大大降低AFP对早期HCC的漏诊率，利于HCC患者进行早期手术治疗，极大地提高患者生存质量。
[0004]在国内，于梅、朱晓美等分别于2011年、2009年制备了兔抗人hCEl多抗(于梅，路胜，刘红.抗人羧酸酯酶I多克隆抗体的制备与鉴定.黑龙江医药，2011，24(4):573-575.朱晓美，李淑珍，吴春铃，等.兔抗人羧酸酯酶I多克隆抗体的制备与鉴定.细胞与分子免疫学杂志，2009, 25(6):516-518.)，但是用于制备hCEl多抗的原核表达蛋白均以包涵体形式存在，而包涵体蛋白必须变性后才能免疫动物制备抗体。变性蛋白可将原有天然蛋白被包在内部的抗原决定簇暴露出来，用来免疫动物具备较强的抗原性。用该变性抗原制备的抗体可以检测变性抗原，但是用于检测天然蛋白(如HCC血清诊断)就会出现较高的假阳性率。于梅、朱晓美等由变性蛋白制备的hCEl多抗的特异性及敏感度均不高，若用于HCC早期诊断则会出现较高的假阳性率。
[0005]因此，本领域迫切需要开发高效表达和纯化重组hCEl蛋白的方法，以便能够大量生产用于优质的抗hCEl单克隆抗体的制备、灵敏度高、高特异性的hCElELISA试剂盒的研制、hCEl药物代谢动力学研究和肝细胞肝癌早期诊断的可溶形式的重组hCEl蛋白。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供一种重组hCEl蛋白的可溶性高效表达和纯化方法。
[0007]本发明提供的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，包括以下步骤:
[0008](1)以生物信息学软件预测hCEl蛋白优势抗原表位区的分布；
[0009](2)用PCR技术扩增含步骤(1)所述的hCEl蛋白优势抗原表位区的基因截短片段；
[0010](3)将步骤(2)得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCEl基因原核表达重组质粒；
[0011](4)将步骤(3)构建的hCEl基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞；
[0012](5)培养步骤(4)所述转化的宿主细胞，以表达重组hCEl蛋白；
[0013](6)分离、纯化步骤(5)所述重组hCEl蛋白。
[0014]作为改进，步骤(1)所述优势抗原表位区是hCEl蛋白第500-567位氨基酸序列区。
[0015]作为改进，步骤(2)所述PCR扩增引物是:
[0016] 正向引物:5'-GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3'；
[0017] 反向引物:5'-CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3'。
[0018]作为改进，步骤(3)所述原核表达载体是pET_42a(+)。
[0019]作为改进，将步骤(2)得到的基因截短片段和pET_42a(+)用限制性内切酶EcoRI和Xho I进行双酶切。
[0020]作为改进，步骤(4)所述宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plys细胞。
[0021]作为改进，步骤(5)所述表达经IPTG诱导，IPTG浓度为0.1mM。
[0022]作为改进，步骤(6)所述分离、纯化包括经2次超声破胞和镍亲和层析法纯化。
[0023]本发明还提供一种重组hCEl蛋白，将hCEl第500-567位氨基酸截短序列插入pET-42a(+)载体的多克隆位点获得。
[0024]本发明对hCEl蛋白的序列进行分析，筛选出了最佳抗原表位，可有效提高抗体识别天然抗原的特异度。确定hCEl蛋白的第500-567位氨基酸序列区为hCEl蛋白的优势抗原表位区。将hCEl蛋白的C末端序列(第500-567位氨基酸)相应的基因序列克隆并构建于大肠杆菌的表达载体中，并利用该表达体系得到了 His-hCEl融合蛋白。
[0025]本发明应用原核表达系统实现了 hCEl蛋白的可溶性表达。应用原核表达系统表达出用于制备优质的hCEl单克隆抗体的可溶性hCEl融合蛋白，与真核表达体系相比，操作简单，成本低廉，具有省时省力的优点。
[0026]采用带有融合标签的pET原核表达载体系统，可以促进融合蛋白的高效表达和纯化，本发明建立的优化原核表达体系可实现较高的蛋白产量。用pET-42a(+)作为载体表达外源蛋白的功能非常强，且可以通过诱导物浓度来控制其目的蛋白的表达水平，该载体在N端有GST标签和His标签，能较方便的通过GST标签或His标签亲和层析纯化，得到较纯的融合蛋白。将重组表达质粒pET-42a(+)/hCEl转化入宿主细胞，经诱导高效表达了主要以可溶形式存在的融合蛋白。
[0027]本发明选用His标签亲和纯化法对初级蛋白产物进行纯化。pET_42a(+)载体含有六聚组氨酸(His)，可融合表达融合蛋白质His-X，其中His接头可与镍离子特异性结合，因此表达的融合蛋白以His标签蛋白纯化树脂(N1-NTA Resin)进行亲和层析纯化，既提高了蛋白产物的质量，又避免了在目的蛋白洗脱过程中的不必要流失，以收获高产高质的His-hCEl融合蛋白。IL大肠杆菌培养物可得到纯度>95%的10_15mg融合蛋白，经WesternBlot鉴定为正确表达。
[0028]本发明重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，达到了理想的蛋白纯度和产量，为后期制备优质的抗hCEl单克隆抗体、抗hCEl多克隆抗体及高特异性的hCEl ELISA试剂盒等研究工作提供了物质基础 。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为hCEl蛋白最佳抗原表位的预测图。
[0030]图2为hCEl基因截短片段PCR产物的琼脂糖电泳分析图；
[0031]M, DNA Marker (2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,IOObp)
[0032]1-3，hCEl PCR产物，PCR扩增hCEl蛋白第500-567位氨基酸序列对应的基因序列。
[0033]图3为重组质粒pET_42a(+)/hCEl酶切鉴定图；
[0034]M, DNA Marker (2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,IOObp)
[0035]I，重组质粒pET_42a (+) /hCE I ; 2，经EcoR I和Xho I双酶切的重组质粒pET-42a(+)/hCElo
[0036]图4为重组质粒pET_42a(+)/hCEl测序结果比对图。
[0037]图5为重组蛋白His-hCEl纯化的SDS-PAGE图；
[0038]M，蛋白 Marker (118kD, 90kD, 50kD, 36kD)
[0039]1，His-hCEl，全细胞；2，His-hCEl，第二次破胞上清；3，His-hCEl，第一次破胞沉淀；4，His-hCEl，洗杂；5-7，His-hCEl，纯蛋白。
[0040]图6 为 His-hCEl 蛋白的 Western Blot 鉴定图；
[0041]1，2，3分别为纯蛋白(lyL)，纯蛋白(2yL)，纯蛋白(5yL)上样。
【具体实施方式】
[0042]为了表达高纯度、可溶的重组hCEl蛋白，本发明实施例以DNAStar软件预测了hCEl蛋白最佳抗原表位区的分布，扩增hCEl蛋白最佳抗原表位区相对应的基因截短片段，选用带有His标签的pET-42a(+)原核表达载体并构建原核表达重组质粒pET_42a (+) /hCEl，经IPTG诱导表达了相应的His-hCEl蛋白，并以镍亲和层析法对蛋白进行了纯化。
[0043]在本发明中，除hCEl蛋白最佳抗原表位的预测、原核表达载体及宿主细胞的选择、蛋白表达及分离纯化条件外，其他工艺条件均采用本领域的常规条件。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照Sambrook等人所编著的《分子克隆实验指南(第三版)》(科学出版社，2002)中所述的方法进行具体实验。[0044]所用到的实验材料为:质粒pCMV-SP0T6_hCEl、pET_42a(+)载体、大肠杆菌菌株DH5a、BL21(DE3)pLysS由长沙赢润生物技术有限公司购得。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4连接酶等工具酶、DNA分子量标准、蛋白分子量标准购自Fermentas公司。PCR引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。
[0045]实施例1 hCEl蛋白最佳抗原表位的预测
[0046]在选择抗原表位区时，主要考量4个参数抗原指数、亲水性、蛋白表面可能性及柔韧性，各项参数的参考标准及对应的预测方法主要为:
[0047](I)抗原指数(Antigenic index) ^ O (Jameson-ffole)；
[0048](2)亲水性(hydrophilcity) ^ O (Kyte-Doolittle)； [0049](3)蛋白表面可及性(Surface probability) ^ I (Emini)；
[0050](4)柔韧性(Flexible regions)无具体参数，可从图形中进行选取(Karplus-Schultz)ο
[0051]利用DNAStar软件对hCEl氨基酸序列的抗原指数、亲水性、蛋白表面可能性及柔韧性参数进行综合分析，如图1所示。各参数的优势氨基酸序列区域如下:
[0052](I)抗原指数
[0053]79-93，101-116，330-342，393-418，451-472，479-492，503-527，551-566;
[0054](2)亲水性
[0055]65-96， 100-112， 125-133， 179-192，332-343，434-470，501-546，550-567;
[0056](3)蛋白表面可及性
[0057]124-132，309-315，444-455，503-510，516-526，534-543，554-563;
[0058](4)柔韧性
[0059]57-115，124-132，208-227，257-319，396-415，435-490，504-543，553-563;
[0060]从以上指标的最优氨基酸序列区域可知，在hCEl的C-端500-567位氨基酸各项指标预测结果均较满意，且位于保守序列区，选取该段序列作为最优抗原表位。
[0061]实施例2 hCEl基因截短片段的PCR扩增
[0062]根据hCEl蛋白的最佳抗原表位区相对应的基因序列，设计合成引物，引物序列为:
[0063]正向引物:5'-GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3/
[0064]反向引物:5'-CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3'
[0065]以pCMV-SP0T6-hCEl为模板，PCR扩增hCEl蛋白第500-567位氨基酸序列相对应的目的基因片段。PCR反应体系(50.0yL):
[0066]表1
[0067]
【权利要求】
1.一种重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于包括以下步骤: (O以生物信息学软件预测hCEl蛋白优势抗原表位区的分布； (2)用PCR技术扩增含步骤(1)所述的hCEl蛋白优势抗原表位区的基因截短片段； (3)将步骤(2)得到的基因截短片段克隆至原核表达载体，构建hCEl基因原核表达重组质粒； (4)将步骤(3)构建的hCEl基因原核表达重组质粒转化宿主细胞，获得转化的宿主细胞； (5)培养步骤(4)所述转化的宿主细胞，以表达重组hCEl蛋白； (6)分离、纯化步骤(5)所述重组hCEl蛋白。
2.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤(1)所述优势抗原表位区是hCEl蛋白第500-567位氨基酸序列区。
3.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增引物是: 正向引物:5' -GGAATTCCATATGGAATTCTGGGCCAACTTTGCTCGC-3/ ； 反向引物:5' -CCGCTCGAGTCACAGCTCTATGTGTTCTGTCTGG-3'。
4.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤(3)所述原核表达载体是pET-42a(+)。
5.如权利要求4所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于将步骤(2)得到的基因截短片段和pET-42a(+)用限制性内切酶EcoR I和Xho I进行双酶切。
6.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤(4)所述宿主细胞是E.coli BL21(DE3)plys细胞。
7.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤(5)所述表达经IPTG诱导，IPTG浓度为0.1mM。
8.如权利要求1所述的重组hCEl蛋白的可溶性表达和纯化方法，其特征在于步骤(6)所述分离、纯化包括经2次超声破胞和镍亲和层析法纯化。
9.一种重组hCEl蛋白，其特征在于:将hCEl第500-567位氨基酸截短序列插入pET-42a(+)载体的多克隆位点获得。
【文档编号】C12N15/70GK103642825SQ201310626175
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月29日 优先权日:2013年11月29日
【发明者】吕媛, 易银沙, 童金英, 王雷, 易尚辉, 刘彩云 申请人:湖南师范大学, 长沙赢润生物技术有限公司