一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的方法
【专利摘要】本发明公开了一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子数量的方法。本发明所提供的定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子数量的方法是基于叶碟诱捕法的创新性定量方法。通过对待测土壤样品、土壤悬浮液浓度、叶碟大小及其数量和培养皿大小、培养时间的严格定量，依据活体大豆疫霉菌游动孢子对大豆叶碟的趋化性和显微镜下大豆疫霉菌游动孢子独特的形态特征，实现对土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子数量的定量检测。本发明方法适合定量检测大豆易发病季节新鲜土壤中的活体大豆疫霉菌游动孢子数量，适合推广应用。
【专利说明】一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及了一种土壤中活体大豆疫霉菌iphytophthora sojae)游动孢子的定量检测方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]大豆疫霉菌sojaeKaufmann & Gerdemann)是引起大豆疫病的病原菌。大豆疫病是公认的世界性大豆病害，由于其危害面积大、程度重，被列为大豆毁灭性
病害之一。
[0003]大豆疫霉菌以卵孢子在土壤中越冬(Schmitthenner, 1985)。越冬后的卵孢子在土壤潮湿、土温适宜的环境中，便萌发产生孢子囊，释放出游动孢子，侵染大豆根系。土壤温、湿度适宜条件下，病株的患病部位可重复产生游动孢子，反复多次地进行再侵染。显然，大豆疫霉菌的游动孢子是直接接种体，因此，检测土壤中游动孢子的数量可为预测该病提供基础数据。
[0004]叶碟诱捕法是国际通用的分离土壤中大豆疫霉菌的主要手段(Canaday等，1982 ；朱振东等，2003 ;王子迎等，2005)，但目前的该方法只能从含有大豆疫霉菌的土壤中分离出大豆疫霉菌，无法实现对土壤中游动孢子数量的准确定量，因而无法满足大豆疫霉菌土壤生态学和病害流行学的定量研究目的。
[0005]目前许多基于DNA分子 的检测技术使得快速、准确地检测疫霉菌成为可能(Cookeet al.，2007)，但还存在很多问题:很难将PCR产物与样品中靶标菌的游动孢子数量联系起来，因为靶标菌的所有菌态均会被检测到，同时靶标菌的死细胞也会被检测出来。因此，目前的基于DNA分子的PCR检测技术也无法实现对土壤中游动孢子数量的准确定量，因而无法满足大豆疫霉菌土壤生态学和病害流行学的定量研究目的。
[0006]大豆疫霉菌的土壤生态学和流行学研究需要对不同土壤生态环境下的活体大豆疫霉菌游动孢子数量进行比较。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的方法，供土壤中大豆疫霉菌生态学和流行学研究过程中游动孢子定量检测之用。
[0008]本发明提供的技术方案是:模拟田间大豆疫霉菌游动孢子的自然存在状态，将一定数量的游动孢子(实际值)接种到一定量的土壤悬浮液中，然后测定在土壤干扰条件下游动孢子的数量(测定值)。用5个游动孢子浓度建立测定值与实际值之间的回归方程，用另外5个游动孢子浓度对方程进行验证。
[0009]本发明的方法是:取5克待测土样，研磨，过Imm筛，放入直径6 cm的无菌培养皿内，加10 ml无菌水充分混匀制成土壤悬浮液。静置2 h后,将18片大豆感病品种‘Sloan’的叶碟(直径10 mm)漂浮在液面上，25°C下诱捕2 h。于显微镜下计数所有18片叶碟边缘诱捕到的游动孢子数量X，代入公式y=1776.6e°-0099x中，即可计算出IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量y。
[0010]应用本发明可以定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的数量。本发明方法是一种检测手段。
[0011]应用本发明得出的公式以及所述的方法，可以定量检测出大豆易发病季节新鲜土样中的大豆疫霉菌游动孢子数量。
【专利附图】
【附图说明】
[0012]图1诱捕2h后叶碟边缘诱捕到的大豆疫霉菌游动孢子
图2 18片叶碟诱捕到的游动孢子数量与IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量之间的关系图。
【具体实施方式】
[0013]下面通过【具体实施方式】的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅做示例说明。
[0014]实施例
病原菌:大豆疫霉菌菌株Eps597-3。
[0015]大豆品种:感病品种‘Sloan’，不含任何已知抗疫霉根腐病基因，种植后长出的叶片用于制备叶碟。
[0016]游动孢子悬浮液的制备方法:
将保存的Eps597-3转移至CA (1000 ml无菌水中加200 g胡萝卜汁，20 g琼脂)平板上活化培养3-4 d。切取5-8块菌饼(直径8 mm)放入无菌培养皿中，加灭菌蒸馏水直至刚好没过菌饼表面。室温下，每30min换一次水，换水4-5次后，放入4°C冰箱中，40min后取出，放在实验台上静止3h后，即可产生大量的游动孢子。移除菌饼，将游动孢子悬液倒入锥形瓶中用力震荡，迅速用微量进样器吸取10 μ 1，于4X 10倍视野下镜检游动孢子数。观察10次取平均值('X )，计算每毫升中的游动孢子量(100 Χ'χ)。用此方法分别配制不同浓度的游动孢子悬浮液。
[0017]将5g研磨并通过Imm筛网的灭菌干土均匀混入10 ml不同浓度(200,400,600,800，1000个游动孢子/ml)的游动孢子悬浮液中，静置2h。将18片大豆感病品种‘Sloan’的叶碟(直径10 mm)漂浮在液面上，25°C下诱捕2 h。显微镜下计数所有18片叶碟边缘诱捕到的游动孢子数量。每个处理3次重复，取平均值。用SPSS17.0数据处理软件建立18片叶碟诱捕到的游动孢子数量(测定值)与IOml 土壤悬浮液中的游动孢子总量(实际值)之间的回归方程。用含有3000、5000、7000、9000、12000个游动孢子的悬浮液对回归方程进行验证。
[0018]结果表明:
叶碟诱捕2h后游动孢子便可在叶碟边缘休止、萌发产生芽管并侵染叶碟。正在侵染叶碟的游动孢子在显微镜下清晰可见并可计数(图1)。试验结果表明，随着土壤悬浮液中游动孢子浓度的增加，叶碟诱捕到的游动孢子数量也逐渐增加(表1)。18片叶碟诱捕到的游动孢子数量与IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量之间的关系符合指数回归方程y=1776.6e°_°°99x，R2~0.99 (图2)。其中x为18片叶碟诱捕到的游动孢子数量，y为IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量。
[0019]为了验证该回归方程，对含有3000，5000, 7000, 9000和12000个游动孢子的IOml悬浮液分别进行了测定和方程式计算。测定值依次为58.33,105.33,141.67,164.67和194.33个游动孢子，而通过回归方程计算得出的值依次为3165.05,5040.31,7222.74、9069.66和12165.07个游动孢子，计算值与实际值之间的偏差在0.77%_3.18%范围内，证明该指数回归方程可用。
[0020]表1 18片叶碟诱捕到的游动孢子数量与IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子
数量之间的关系_
【权利要求】
1.一种定量检测土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子的方法，是将土壤制成悬浮液，将不含任何已知抗病基因的感病大豆品种‘Sloan’的叶碟漂浮在液面上，诱捕其中的大豆疫霉菌游动孢子，依据叶碟边缘诱捕到的大豆疫霉菌游动孢子数量，代入公式y=1776.6e°-0099x中进行计算。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:公式y=1776.Bea 0099x是用于定量检测大豆易发病季节新鲜土壤中的活体大豆疫霉菌游动孢子。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述公式y=1776.Bea 0099x中的x为18片叶碟边缘诱捕到的游动孢子数量，y为IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量。
4.根据权利要求1、2、3所述的任一方法，其特征在于:使用公式y=1776.Bea 0099x的具体做法是:取5克大豆易发病季节的新鲜待测土样，研磨，过Imm筛，放入直径6 cm的无菌培养皿内，加10 ml无囷水充分混勾制成土壤悬浮液；静直2 h后,将18片大?感病品种‘Sloan’的叶碟(直径10 mm)漂浮在液面上，25°C下诱捕2 h ;于显微镜下计数所有18片叶碟边缘诱捕到的游动孢子数量X，代入公式y=1776.6e°-0099x中，即可计算出IOml 土壤悬浮液中实际存在的游动孢子数量I。
5.权利要求1-4任一所述方法在定量检测大豆易发病季节新鲜土壤中活体大豆疫霉菌游动孢子中的应用 。
【文档编号】C12Q1/06GK103820523SQ201310667917
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2013年12月11日 优先权日:2013年12月11日
【发明者】文景芝, 田苗, 李永刚, 肖彩霞, 所冰 申请人:东北农业大学