与细胞色素p450酶共表达的细胞模型构建及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，将CYPA3A4的表达质粒pcDNA3.1-Hygro-CYP3A4转染MDCK-mock，MDCK-hOCT1细胞，经潮霉素及G418抗性筛选，获得具有稳定抗性的单克隆细胞，通过westernblot检测CYP3A4的蛋白表达，获得稳定单表达CYP3A4及稳定共表达CYP3A4，hOCT1的细胞，用经典底物及抑制剂进行功能验证。本发明建立的细胞模型可以用于细胞水平专属性研究CYP3A4的作用，及研究hOCT1及CYP3A4的共同作用，预测药物在肝脏的处置情况，预测可能由CYP3A4,hOCT1介导的药物相互作用。本发明设计合理，专属性和重复性好。
【专利说明】与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物领域，涉及一种共表达人有机阳离子转运体I及细胞色素P450酶细胞模型的构建及应用。
【背景技术】
[0002]人肝脏表达多种药物代谢酶和转运体，是药物体内处置的重要器官。细胞色素P450 (CYP)是人肝脏中最主要的一相代谢酶，它们介导药物的氧化还原反应，使药物失活或激活。CYP3A4是肝脏中表达最多的CYP酶，占其总CYP酶的30%，目前临床应用的药物中近50%由CYP3A4代谢[I]。由于CYP3A4底物谱广，因此由其介导的药物_药物相互作用也十分普遍[2]。膜转运体介导大量药物及其代谢物的摄取和外排，是很多药物体内处置的决定性因素，因此转运体在药物-药物相互作用过程中也发挥着重要作用[3，4]。临床上有近40%的口服药物为弱碱性化合物，在生理pH条件下部分或全部以阳离子存在[5]，因此它们进出细胞往往需要由膜转运蛋白介导，有机阳离子转运体Korganic cation transporter1，0CT1)即是其中一种。人OCTl是肝脏中一种重要的膜转运蛋白，可介导许多阳离子化合物的摄取[6]。鉴于代谢酶和转运体对药物处置的重要作用，药物与代谢酶、转运体的相互作用研究已成为新药研发过程中不可或缺的研究内容，对其成药性评价具有重要指导意义。由于转运体与代谢酶存在广泛的底物谱交叉性，因而体外研究中需要综合考量它们共同的作用。体外研究常用的永生化肝细胞系，如H印G2，HepaRG, Huh7,以及L-02等[7，8]，由于代谢酶与转运体表达的缺失或过低，不适合进行药物转运与代谢研究；而人源的细胞器、组织等来源有限、成本高，且很难研究专一酶的作用或/及其与转运体的共同作用。因此稳定表达人转运体/CYP酶的转基因细胞模型，是一种较理想的体外研究模型。本研究在已有稳定表达hOCTl细胞模型[9]的基础上，建立稳定表达人CYP3A4的马丁达比狗肾上皮(MDCK)细胞模型及共表达hOCTl和CYP3A4的MDCK细胞模型，为体外专一的研究hOCTl，CYP3A4及两者的共同作用提供·了有效的细胞模型。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是提供一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，是一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，也是一种稳定高表达CYP3A4及共表达hOCTl, CYP3A4的MDCK (马丁达比狗肾上皮)细胞模型的构建，通过以下步骤实现:
通过设计含有Kpn I ,Xho I两个酶切位点的引物(引物序列如SEQ ID No: 1，2所示)，将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4 cDNA (核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示)克隆于载体质粒pcDNA3.1 (+) -Hygro上,构建表达质粒pcDNA3.1 (+) -Hygro_CYP3A4。表达质粒转染MDCK-pcDNA3.1 (+)及MDCK_h0CTl细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选,挑选单克隆细胞,单克隆细胞进行western blot验证CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4的MDCK-CYP3A4及MDCK_h0CTl_CYP3A4细胞，并通过Westernblot从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过特定引物(引物序列如SEQ ID No: 4-9所示)进行Real-time PCR验证细胞中CYP3A4及hOCTl的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK-hOCTl进行比较，进而以P450-Glo ? CYP3A4 Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察经典抑制剂酮康唑对代谢活性的影响，从而进一步确认转染细胞CYP3A4的功能。此外，应用 hOCTl 突光底物 4-(4-(dimethylam1-no) styryl)-N-methylpyridinium(ASP+),结合hOCTl抑制剂四乙胺(TEA)验证细胞hOCTl的功能。
[0004]本发明的另一个目的是提供所构建的模型在研究CYP3A4及hOCTl介导的肝脏毒性中的应用。通过以下步骤实现:单转、双转及mock细胞给予不同浓度的待测化合物，孵育一定时间，采用MTT法检测细胞的存活率。通过比较单表达、共表达hOCTl或/和CYP3A4的细胞及mock细胞的存活率来说明hOCTl及CYP3A4在待测化合物的细胞毒性中起的作用。
[0005]以倒千里光碱为例，转染CYP3A4的细胞才会显示出毒性，说明CYP3A4的代谢作用是倒千里光碱产生毒性的关键步骤，而MDCK-h0CTl-CYP3A4细胞的显示出最明显毒性效果，说明两个蛋白均在毒性过程发挥作用；以氯化两面针碱为例，MDCK-hOCTl细胞存活率最低，说明hOCTl介导的细胞摄取是化合物产生毒性的关键步骤，而双转hOCTl及CYP3A4的细胞存活率较MDCK-hOCTl高，说明CYP3A4介导的代谢是减毒过程。两个例子均说明，两个化合物均是hOCTl及CYP3A4的共同底物。
[0006]本发明建立的细胞模型可以用于细胞水平专属性研究CYP3A4的作用，同时可以研究hOCTl及CYP3A4的共同作用，预测药物在肝脏的处置情况，预测可能由CYP3A4，hOCTl介导的药物相互作用。本研究获得的细胞模型，已经初步筛选到几个hOCTl及CYP3A4的共同底物，并被进一步应用于化合的毒性研究，阐明了化合物经hOCTl和CYP3A4介导的肝脏毒性机制。本发明设计合理，专属性和重复性好。[0007]本发明的积极效果是:(I)肝脏是药物代谢的主要器官，而CYP3A4是肝脏内表达量最高，底物谱最广的CYP酶，但是CYP酶在体外哺乳动物细胞内稳定表达困难，本研究成功构建了稳定表达CYP3A4的MDCK细胞模型，可以用于在细胞水平专一研究CYP3A4的作用。(2)CYP3A4及hOCTl均在肝脏高表达，前者是重要的代谢酶，后者是重要的转运体，两者存在广泛的底物交叉性，本研究成功建立稳定共表达hOCTl及CYP3A4的细胞模型，可以有效的地研究两者对药物代谢转运的共同作用，及转运体、代谢酶共同介导的药物相互作用。(3)很多外源物质通过转运体进入肝细胞，可能通过代谢增毒或减毒，利用本研究建立的细胞模型，可以体外专一研究这一途径的致毒机制，寻求解毒办法。
[0008]
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是质粒pcDNA3.1 (+) -Hygro_CYP3A4及其对应的酶切产物电泳鉴定。
[0010]图2 是 Western blot 检测 MDCK-CYP3A4_h0CTl 细胞内的 CYP3A4 蛋白表达。
[0011]图3是Western blot检测MDCK-CYP3A4细胞内的CYP3A4蛋白表达。
[0012]图4是Western blot比较细胞内的CYP3A4的蛋白表达。
[0013]图5是Real-time PCR检测不同细胞中hOCTl, CYP3A4 mRNA的相对表达量。
[0014]图6是Luciferin-1PA验证在抑制剂存在与否时CYP3A4的活性。
[0015]图7是不同细胞在有或无hOCTl抑制剂存在下对ASP+的积聚。
[0016]图8是倒千里光碱对单表达、共表达hOCTl及CYP3A4细胞的毒性。[0017]图9是hOCTl及CYP3A4对氯化两面针碱细胞毒性的影响。
【具体实施方式】
[0018]本发明结合附图和实施例作进一步的说明。
[0019]实施例1
1.CYP3A4表达质粒的构建和鉴定
设计上下游分别带有Kpn I，Xho I酶切位点的人CYP3A4专属性引物，其中酶切位点下划线标出，□标出的为编码六个组氨酸的基因序列，引物序列如下:
SEQ ID No:1 Forward: 5’ - ATTGGTACCATGGCTCTCATCCCAGACTTGG-3’
SEQ ID No: 2 Reverse: 5’ - ATTCTCGAGTCAATGATGATGATGATGATGGGCTCCACTTACGGTGCC-3’
利用上述引物从实验室人基因库中钓取CYP3A4 cDNA (已经在该基因开放阅读架的终止密码子之前插入了编码6个组氨酸的基因序列)[10]，其核苷酸序列如SEQ ID No:3所示。以pcDNA3.1 (+) -Hygro质粒(购自Invitrogen公司)为载体，将CYP3A4 cDNA通过Kpn I，Xho I两个酶切位点克隆于该载体上，命名为pcDNA3.l(+)-Hygro-CYP3A4，作为表达质粒。用E.coli DH5 α菌株扩增质粒，将菌种置于含氨苄的LB固体培养基上，37°C孵箱培养过夜。待次日培养基上长出菌斑后，挑取单菌落于含氨苄的LB液体培养基中扩增，使用Axygen试剂盒提取纯化质粒，用Kpn I ,Xho I两个限制性内切酶进行双酶切鉴定，酶切体系(IOyL):pcDNA3.1 (+)-Hygro-CYP3A4 质粒 5 μ L，IOXM buffer I μ L, Kpn I I μ L,Xho I 1μ L，灭菌水2 μ L。37°C，2h。经1%的琼脂糖凝胶电泳鉴定(见图1 )，酶切得到约
1.5kb的CYP3A4目的基因片段及约5.6kb的pcDNA3.1 (+)-Hygro载体片段，鉴定正确的质粒用于细胞转染。图1中1，2，3，4泳道为四个完整的质粒样品；5，6，7，8泳道为相应的酶切样品，得到两个条带，约1.5kb的CYP3A4目的基因，约5.6kb的载体片段。质粒经测序表明，成功连接带有组氨酸(His)标签的CYP3A4 cDNA，基因全长无碱基突变。
[0020].MDCK系列细胞的稳定转染
MDCK-pcDNA3.1 (+)细胞及MDCK-hOCTl细胞以2 X IO5/孔种于6孔板，待细胞覆盖70-80% 时开始转染。将 2.5μ g pcDNA3.1 (+)-Hygro_CYP3A4 质粒稀释于 ΙΟΟμΙ 无血清 DMEM,再加入 2.5 μ IPLUS ? Reagents,室温孵育 5min,与含有 5 μ ILipofectamine ? LTX 的无血清DMEM ΙΟΟμΙ体系混合，室温孵育30min。将脂质体质粒络合物滴加于已经含有ΙΟΟΟμΙ无血清DMEM的待转染细胞中，前后轻轻摇匀，6h后更换为含10%血清DMEM培养基，继续培养48h后，换为含700 μ g/mL G418及400 μ g/mL潮霉素B的含10%血清培养基进行细胞筛选。抗性筛选10-14天，待对照组细胞全部死亡，转染组细胞大量生长，将细胞消化，采用有限稀释法种入96孔板中。显微镜下挑选单克隆细胞，用含700 μ g/mL G418，400 μ g/mL潮霉素B的培养基继续培养，隔天换液。继续培养约10天后，单克隆细胞长成较大一团，消化，转入24 孔板培养。同时 MDCK-pcDNA3.1 (+)及 MDCK-hOCTl 细胞均转染 pcDNA3.1 (+) -Hygro 空载体质粒作同法抗性筛选，作为对照细胞。至此，共获得四种具有稳定抗性的细胞MDCK-mock(MDCK 共转染 pcDNA3.1 (+)及 pcDNA3.1 (+) -Hygro 空载体质粒)，MDCK-hOCTl (MDCK 共转染pcDNA3.1 (+) -hOCTl 质粒及 pcDNA3.1 (+) -Hygro 空载体质粒)，MDCK_CYP3A4 (MDCK 共转染pcDNA3.1 (+)空载体质粒及 pcDNA3.1 (+) -Hygro_CYP3A4 质粒)，MDCK_h0CTl_CYP3A4 (MDCK共转染 pcDNA3.1 (+) -hOCTl 及 pcDNA3.1 (+) -Hygro_CYP3A4 质粒)。
[0021].Western blot检测单克隆细胞CYP3A4的蛋白表达
3.1蛋白样品的制备
将获得的单转染CYP3A4及共转染hOCTl和CYP3A4的单克隆细胞继续培养，待细胞长满细胞瓶后用冰冷的PBS清洗三次，用细胞刮刀刮下，于4°C，2000g离心5min，收集细胞，加入含有PMSF，Aprotimin和Leup印tin等蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液150 μ 1，吹打混匀，冰上裂解30min，期间反复吹打几次，裂解完成后4°C，13000g离心5min，取上清液即为总蛋白样品，分装于_80°C保存待用。蛋白样品采用BCA法测定蛋白浓度，计算出50 μ g蛋白所需蛋白样品体积，并加入4μ I 5XSDS上样缓冲液，加水补足为20μ I上样体系，样品于沸水中煮IOmin即可上样。
[0022]3.2 Western blot法挑选有CYP3A4表达的单克隆细胞
SDS-PAGE凝胶电泳采用5%浓缩胶，7.5%分离胶，20 μ g蛋白上样，90V电泳30min，120V电泳60min，PVDF膜在200mA，冰浴条件下转膜2h。用TBST缓冲液配制7.5%脱脂奶粉，转膜结束取出转印膜于脱脂牛奶中封闭2h，目的条带(CYP3A4)—抗为小鼠抗His单克隆抗体I:1200稀释，内参(GAPDH)—抗为小鼠抗GAPDH单克隆抗体1:20000稀释，4°C孵育过夜，TBST洗膜5minX6次，辣根过氧化酶标记山羊抗小鼠二抗1:5000稀释，室温孵育2h，同前述方法洗膜。EZ-ECL Chemiluminescence Detection Kit (ECL)的化学发光试剂 A 液、B液适量，1:1混匀滴加于膜上，反应3min，将膜蛋白面朝上在曝光盒内放置，用医用X射线胶片压片数秒，自动洗片机洗片。挑选结果参见图2，图3。图2中D1-D91为挑选出的有明显CYP3A4表达的双转染hOCTl及CYP3A4的单克隆细胞；mock为转染空载体的MDCK细胞，M/0为单表达hOCTl的细胞，作为两个阴性对照；Sf9为已经确认表达CYP3A4的昆虫细胞表达系统，作为阳性对照。图3·中S3，S4, S56, S57为挑选出的有明显CYP3A4表达的单转染CYP3A4的单克隆细胞；mock，MDCK-hOCTl为阴性对照；Sf9为阳性对照。
[0023]经过western blot反复比较,从以上细胞中挑选出CYP3A4表达量相当的单转染及双转染细胞，以便后续研究中在酶活性相当的情况下比较hOCTl的作用。参见图4，编号为S4的单转染细胞及编号为D60的双转染细胞中CYP3A4蛋白表达量基本一致，正式命名为MDCK-CYP3A4及MDCK_h0CTl_CYP3A4。图4中S4为挑选出的有明显CYP3A4表达的单转染CYP3A4的单克隆细胞，D60为与S4中CYP3A4表达量相当的共表达CYP3A4及hOCTl的单克隆细胞，mock为空载体对照细胞;M/0为MDCK-hOCTl细胞。
[0024]检测单克隆细胞hOCTl, CYP3A4 mRNA的表达量
使用 RNAsimple Total RNA Kit 总 RNA 提取试剂盒(RNAsimple Total RNA Kit,天根)，提取 MDCK-mock，MDCK-CYP3A4，MDCK-hOCTl, MDCK_h0CTl_CYP3A4 细胞的总 RNA，提取完成后进行总 RNA 浓度测定。使用 PrimeScript?RT reagent Kit (Perfect Real Time,Takara)将总RNA反转录为cDNA，反应体系按表1配制，剩余RNA于_80°C保存。反转录条件为:37°C，15 min (反转录反应)；85°C，5 sec (反转录酶的失活反应)；4 °C。表1反转录反应体系
【权利要求】
1.一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型构建，其特征在于，通过以下步骤实现: 设计含有Kpn I，Xho I两个酶切位点的引物，引物序列如SEQ ID No: 1，2所示，将终止密码子之前带有组氨酸标签的人CYP3A4 cDNA克隆于载体质粒pcDNA3.1 (+) -Hygro上，构建表达质粒pcDNA3.1 (+) -Hygro-CYP3A4,表达质粒转染MDCK_pcDNA3.1 (+)及MDCK-hOCTl细胞，转染后通过氨基糖苷类抗生素G418及潮霉素B进行抗性筛选，挑选单克隆细胞，单克隆细胞进行western blot验证CYP3A4的蛋白表达，得到稳定表达CYP3A4 的 MDCK-CYP3A4 及 MDCK_hOCTl_CYP3A4 细胞，并通过 Western blot 从中挑选出CYP3A4蛋白表达量一致的细胞，提取总RNA，通过引物序列如SEQ ID No: 4_9所示的特定引物进行Real-time PCR验证细胞中CYP3A4及hOCTl的mRNA表达，并与空载体细胞及MDCK-hOCTl进行比较，进而以P450-Glo ? CYP3A4 Assay试剂盒检测CYP3A4活性，并考察酮康唑对代谢活性的影响，从而确认转染细胞CYP3A4的功能；应用hOCTl荧光底物4- (4- (dimethylam1-no) styryl) -N-methylpyridinium,结合 hOCTl 抑制剂四乙胺验证细胞hOCTl的功能；其中人CYP3A4 cDNA的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示。
2.根据权利要求1所述方法构建的一种与细胞色素P450酶共表达的细胞模型在研究CYP3A4及hOCTl介导的肝脏毒性中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过以下步骤实现:单转、双转及mock细胞给予不同浓度的待测化合物，孵育一定时间，采用MTT法检测细胞的存活率，通过比较单表达、共表达hOCTl或/和CYP3A4的 细胞及mock细胞的存活率确认hOCTl及CYP3A4在待测化合物的细胞毒性中作用。
【文档编号】C12N5/10GK103710385SQ201310710442
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2013年12月22日 优先权日:2013年12月22日
【发明者】蒋惠娣, 涂美娟, 李丽萍, 郑世瑞, 陈忠坚, 孙思源, 周慧, 曾苏 申请人:浙江大学