预测强直性脊柱炎易感性的试剂的制作方法
【专利摘要】本发明公开了预测强直性脊柱炎易感性的试剂，属于医学生物【技术领域】。本发明通过提取宿主细胞的基因组DNA，测定受试者的NCR3基因SNP位点的基因型，预测受试者对强直性脊柱炎的易感性。本发明的优点是：首次阐述了NCR3基因多态性位点与强直性脊柱炎的相关性，提供了一种预测强直性脊柱炎易感性的方法，该方法可用于强直性脊柱炎的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
【专利说明】预测强直性脊柱炎易感性的试剂
【技术领域】
[0001]本发明涉及预测强直性脊柱炎易感性的试剂，更具体的说是通过测定与AS相关基因NCR3的多态性预测受试者对于强直性脊柱炎的易感性，该方法可用于疾病的辅助诊断、治疗和新药开发，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一种自身免疫性疾病，多发于16-40岁的青壮年，男女患病比例约为4~10:1。病变常首先发生于骶髂关节，少数重症患者表现为整个脊柱强直。此外，部分患者伴有不同程度的髋关节、眼、肺、心血管、肾等脊柱外病变。AS在白种人群中的发病率约为1%~3%，我国AS患病率约为0.2-0.6%，其中60%以上的患者伴有髋关节受累，致使20%以上AS患者残疾，炎症主要累及关节囊、肌腱和韧带的骨附着点，导致局部关节粘连强直，活动受限。临床上至今尚缺乏可明显缓解和控制疾病发展的药物。AS属多基因疾病，具有明显的遗传倾向，虽然通常认为遗传与免疫因素在AS发病中起主导作用，但确切的病因与发病机制仍不清楚。
[0003]目前进行AS遗传病因研究，多采用SNP作为基因组标志的关联分析方法，是有效的，已得到证明。SNP是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，在人群中的频率需>1%，SNPs是双等位基因标记，这种单碱基变化中有70.1%为同型碱基之间的转换:如G/A或T/C，29.1%为发生在嘌呤和嘧啶之间的颠换。C (胞嘧啶)是人类基因组中最易发生变化的位点，因为大多数是甲基化胞嘧啶，能够自发脱氨基转换为T (胸腺嘧啶)，SNP包含了已知多态性的80-90%，是最常见的遗传变异。
[0004]由于生存的选择压力导致SNP在单一基因和整个基因组中的分布呈不均匀性。SNPs在基因非编码区的数量是编码区的4倍，总数可达3百万个。SNP以其密度高(平均每Ikb就有I个)、代表性强(位于基因内部的SNP可能直接影响蛋白质结构或表达水平)、遗传稳定性好(同微卫星多态性比较而言)、易于自动化分析(因SNP在人群中多为双等位基因标记，可简单以“+ / 一或1/0”直接分型)等特点成为很好的遗传标志。
[0005]1973年，Brewerton等首先发现了与AS强相关的人类白细胞抗原_B27(HLA_B27 )。随着研究的进展，与AS相关的其他易感基因如肿瘤坏死因子-α (TNF-α )、白介素-1(IL-1)陆续被识别。
[0006]NCR3(natural cytotoxicity triggering receptor3,天然细胞毒作用触发受体)基因位于6q21.3，全长4103bp。该基因定位于人类白细胞抗原III区域，与免疫反应及自身性免疫疾病发生发展等密切相关。
[0007]NCR3基因与AS相关联的研究近些年尚无报道。
【发明内容】
[0008]本发明的主要目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的方法。
[0009]本发明的第二个目的是提供一种预测强直性脊柱炎易感性的试剂盒，包括PCR引物和含有该引物的试剂盒。
[0010]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案:
[0011]检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，为序列表SEQ ID N0.1所示碱基序列。其31556922位置即是变异位点，以字母“R”标示出。该核酸序列为NCR3基因部分序列。图1为NCR3基因部分结构及其多态性变异位点的示意图，附图中包含有4个外显子，31556922标在NCR3基因图中第4外显子区的相应位置。
[0012]一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，检测受试者NCR3基因第4外显子区31556922位置的基因型，基因型为GG时，受试者的易感性最低；携带A等位基因时，受试者的易感性升高。
[0013]一组检测强直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ IDN0.2和序列表SEQ ID N0.3所示，长度分别为22bp和23bp，这组引物可以特异性地扩增出包含有SEQ ID N0.1所示序列中31556922位置的产物。
[0014]本发明提供了一种检测强直性脊柱炎易感性的诊断试剂盒，其中含有本发明特异性扩增NCR3基因31556922位点的引物对和用于PCR扩增检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟知这些常规组件和检测方法。本发明试剂盒中的全部组分和含量如下:
[0015]一种检测强`直性脊柱炎易感基因的试剂盒，由以下试剂组成:
[0016](I) 20 μ LlOXPCR 缓冲液；
[0017](2 ) 2 μ LlOmMdNTP 混合液；
[0018](3) 2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019](4) IyL上游引物F1，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ;
[0020](5) IyL下游引物R1，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为IOpmol/μ L ；
[0021](6) 8 μ LlOXLC-Green Plus 饱和荧光染料；
[0022](7)2μ L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5μ L组成，浓度为lOpmol/μ L，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
[0023](8) 64 μ L 纯水。
[0024]使用方法:
[0025](I) PCR扩增:通过PCR扩增NCR3基因的第4外显子区部分片段，制备混合液:10 X PCR 反应缓冲液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L，10pM/L 上游引物
0.1“1^，10?厘/1下游引物0.1 μ L，I X LC-Green Plus饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参
0.2yL (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加纯水至10 μ L。PCR反应条件为95°C预变性3min，95°C变性30s，69°C退火30s，72°C延伸4s,总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min,94°C 30s, 24°C 2min。PCR 前于每一体系中加入 20 μ L 的石蜡油，以防止液体挥发。
[0026](2)基因型判定:将PCR产物移入HRM专用96孔板内，在Light Scanner TMHR-196上进行HRM分析,用Light Scanner Call IT软件对采集后的曲线进行分析,根据熔解曲线的差异判定基因型。
[0027]NCR3基因第4外显子区31556922多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。 [0028]本发明的测定方法测定了来源于人的基因组DNA，样品来源无限制，如:体液(血液、腹水及尿液等)、组织细胞(如肝组织)等。通过提取和纯化这些样品可制备基因组DNA。调整基因组DNA的浓度，使其尽可能的一致。以基因组DNA为模板，可扩增出含NCR3基因突变位点的核酸片段，以获取测定的大量样本。这种通过扩增含NCR3基因变异点的DNA片段获得的样品，特别适于用作测定材料。
[0029]在进行基因辅助诊断时，本发明优先适用于测定根据NCR3基因的突变类型存在的辅助诊断试剂，辅助诊断试剂包括作为必要成分的特定试剂，其对应于用于测定NCR3基因突变类型的方法。按采用的测定方法来选择适当的特定试剂，如DNA片段和/或用于PCR扩增步骤的引物。
[0030]本发明的优点是:本发明首次阐明了 NCR3基因多态性位点与AS的相关性，提供了一种预测AS易感性的方法，该方法可用于AS的预防、辅助诊断和治疗，还可以用于新药研发。
[0031]下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步叙述，以便公众对
【发明内容】
有更深入的了解，并非对本发明的限制，凡依照本发明公开内容所做的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1为NCR3基因结构及31556922位置示意图
[0033]图2为NCR3基因变异位点经HRM方法的基因分型图
[0034]图3为NCR3基因变异位点的测序图
【具体实施方式】
[0035]用于下列实施例中表示试剂的英文缩写如下:
[0036]10XPCR 缓冲液:10mM Tris-HCI (pH=8.3), 500mM 氯化钾(KCl)，IOmM 氯化镁(MgCl2)70.01%(W/V)白明胶
[0037]dNTP:脱氧核苷三磷酸
[0038]EDTA:乙二胺四乙酸二钠
[0039]TE: IOmM Tris-HCl (pH=7.5)，ImM EDTA (pH=8.0)
[0040]实施例1:血液样本收集和基因组DNA的提取:
[0041]一.病例入选:
[0042]1.按纽约1984年的修订诊断标准入选病例，共选取来自宁夏地区无血缘关系的AS患者350例(年龄:8-71岁，平均27岁)，同地区的健康对照志愿者360例(年龄:18-21岁，平均19岁)。所有受检者均为汉族且签署书面知情同意书，这项研究得到卫生部北京医院，卫生部老年医学研究所伦理审核委员会的认可，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》:人体医学研究的伦理原则。
[0043]二.根据下列方法，制备人基因组DNA。[0044]1.在已标号的1.5mLEP管中加1000 μ L红细胞裂解液，后加入400 μ LEDTA抗凝血(抗凝血加入前颠倒混匀3-5次)，颠倒混匀，室温静置10分钟；
[0045]2.13000rpm离心30秒后，除去上清液；
[0046]3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，弹击管壁，充分混匀后加入20 μ L蛋白酶K (用裂核液稀释20倍稀释蛋白酶K)，颠倒混匀，65°C孵箱10分钟，(期间不时上下混匀，确保无凝块);
[0047]4.拿出后降至室温，加300μ L蛋白沉淀液，充分颠倒混匀，静置10分钟，13000rpm离心2分钟；
[0048]5.将上清液移至新EP管中，加入670 μ L预冷的异丙醇，充分颠倒混匀(10次以上)，可见线状DNA逐渐形成小团块，13000rpm离心2分钟；
[0049]6.弃上清液并确保沉淀留在EP管中，加入670 μ L70%乙醇，上下颠倒混匀，13000rpm离心2分钟；
[0050]7.弃上清，使管内乙醇挥发干净；
[0051]8.加入TE溶液(400 μ L)，充分溶解，对提取的基因组DNA进行浓度和纯度的分析，吸取部分DNA溶液作为工作液，浓度校正至20ng/ μ L，置于4°C备用，剩余基因组DNA置_20°C冰箱保存。
[0052]实施例2SNP的识别鉴定
[0053]本发明采用PCR-高分辨率熔解曲线(HRM)分析法和PCR测序技术同时对NCR3基因第4外显子区31556922位置(其等位位点为G/A)的基因型进行检测。
[0054]一.PCR-HRM弓丨物的确定
[0055]从Genebank中查取31556922位置附近的DNA碱基序列(SEQ ID N0.1)，引物设计在01igo7.0软件下完成。目的片段定位在NCR3基因第4外显子区，全长46bp，特异性引物序列如下:
[0056]Fl:5，-GGAAAGGTCCAAGAAGGCAGCT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0057]Rl:5，-TTTTGCGCTGGGACCACAGTCGG-3’ (SEQ ID N0.3)
[0058]二.PCR-HRM反应体系及条件
[0059]1.通过PCR扩增NCR3基因第4外显子区部分片段。
[0060]通过PCR扩增NCR3基因第4外显子区部分片段，PCR反应体系为:10 XPCR反应缓冲液 I μ L, 10mM/LdNTP0.2 μ L, TaqDNA 聚合酶 0.2 μ L, 10pM/L 上游引物 0.1 μ L, IOpM/L下游引物0.1 μ L，IOXLC-Green Plus饱和荧光染料0.8 μ L，寡核苷酸内参0.2 μ L (高、低温寡核苷酸内参上、下游引物各0.05 μ L)(序列见表1)，基因组DNAl μ L，加去离子水至IOyL0 PCR时于每一体系中加入20 μ L石蜡油，防止液体挥发。PCR反应条件为95°C预变性3min，95°C变性30s，69°C退火30s，72°C延伸4s，总共45个循环，72°C总延伸2min。在进行高分辨熔解曲线分析之前，进行变性和复性处理:95°C 30s, 25°C 2min，94°C 30s,24°C 2min。
[0061]表1:高、低温寡核苷酸内参引物序列、退火温度及产物片段长度
[0062]
【权利要求】
1.检测强直性脊柱炎易感性的核酸序列，其特征在于:为序列表SEQID N0.1所示碱基序列。
2.一种检测强制性脊柱炎易感性的方法，其特征在于:检测受试者NCR3基因第4外显子区31556922位置的基因型，基因型为GG时，受试者的易感性最低；携带A等位基因时，受试者的易感性升高。
3.—组检测强直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于:引物的核苷酸序列分别为序列表SEQ ID N0.2和序列表SEQ ID N0.3所示。
4.一种检测强直性脊柱炎易感基因的试剂盒，其特征在于由以下试剂组成:
(1)20 μ LlO X PCR 缓冲液；
(2)2 μ LlOmMdNTP 混合液；
(3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ; (4)IyL上游引物F1，为SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列，浓度为10pmol/yL； (5)IyL下游引物R1，为SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，浓度为lOpmol/yL; (6)8 μ LlOXLC-Green Plus 饱和荧光染料； (7)2 μ L寡核苷酸内参，由4种内参引物各0.5 μ L组成，浓度为IOpmol/μ L，其中低温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列，低温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.5所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参上游引物F为SEQ ID N0.6所示的核苷酸序列，高温寡核苷酸内参下游引物R为SEQ ID N0.7所示的核苷酸序列；
(8)64 μ L 纯水。`
5.NCR3基因第4外显子区31556922多态性位点在制备诊断或治疗强直性脊柱炎的试剂或药物中的用途。
【文档编号】C12N15/11GK103695549SQ201310711410
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】杨泽, 张玉荣, 赵承孝, 刘铭, 王建业, 史晓红, 魏东, 杨帆, 朱小泉, 周林, 张耀光, 王娜娜, 惠娟, 张政, 唐雷, 孙亮 申请人:卫生部北京医院