一种低温内切β-2,6-果聚糖酶LevAGN25及其编码基因的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种果聚糖酶及其编码基因。本发明的果聚糖酶具有以下性质：最适pH6.0；最适温度55℃，在10℃和20℃下分别具有13.5%和32.6%的酶活；经0.1M?pH5.0–10.0缓冲液在37℃下处理60min，仍能保持70%以上的活性；50℃时半衰期大于60min；内切Levan生成果寡糖。本发明的果聚糖酶可应用于食品、水产饲料及医疗行业。
【专利说明】—种低温内切β -2, 6-果聚糖酶LevAGN25及其编码基因
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】，尤其涉及一种低温内切β-2，6-果聚糖酶LevAGN25及其编码基因。
【背景技术】
[0002]果聚糖(Fructan)是由果糖通过β _2，6糖苷键或β _2，I糖苷键连接而成的多聚糖。由β _2，6糖苷键连接而成的果聚糖称为Levan，主要存在于单子叶植物，如梯牧草和细菌的胞外多糖，如牙菌斑形成相关菌Streptococcus salivarius和Actinomyces viscosus等；Levan可作为细菌生物膜的组成成分，帮助细菌粘附、定殖并抵抗抗生素等，造成生锈、污染及牙菌斑等问题。菊粉(Inulin)是一种由β _2，I糖苷键连接而成的果聚糖，主要存在于双子叶植物中，如菊芋、菊苣、大丽花、牛蒡和雪莲果等植物的根和茎中。同时由β_2，I和β _2，6糖苷键连接而成的果聚糖称为Graminan,存在于在许多高等植物中，如小麦、大麦及燕麦中(Han, Adv Appl Microbiol, 1990, 35:171 - 194; Rozen et al., FEMSMicrobiolLett,2001, 195:205 - 210)。
[0003]糖苷水解酶第32家族包括内切菊粉酶、外切菊粉酶、蔗糖酶及内切β-2，6_果聚糖酶(Endolevanase) (Finn et al.Nucleic Acids Res, 2008，36:D281 - D288)。内切β-2，6-果聚糖酶从Levan内部随机水解β _2，6糖苷键，可应用于饲料、食品和医疗等行业中。在饲料行业中，内切β _2，6-果聚糖酶可以辅助养殖动物水解植物，如梯牧草中的β _2，6糖苷键型果聚糖，促进动物对营养物质的消化，提高饲料利用率；在食品行业中，内切β _2，6-果聚糖酶可以水解β _2，6糖苷键型果聚糖并生成果寡糖、破坏细菌生物膜的形成进而降低细菌污染、以及作为测定果聚糖类型的试剂盒组分等；在医疗行业中，内切β -2，6-果聚糖酶可防止细菌形成生物膜，进而防治牙菌斑或细菌对医疗器械的粘附和污染；另外，内切β _2，6-果聚糖酶也可作为添加剂应用于清洁用品中(U.S.Pat.N0.6524827)。
[0004]具有低温活性的酶可应用于低温生境和低温加工过程，如低温下的食品加工、医疗器械清洗及水产饲用酶领域。低温下的加工过程可防止微生物的污染、营养损失和食品品质降低，将中温或者高温加工的过程转为低温加工过程还可起到降低能耗的作用(Zhouet al., J Biosci Bioeng, 2012，113:568 - 574)。
【发明内容】
[0005]本发明的目的本发明的目的是提供一种低温内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25。
[0006]本发明的再一目的是提供编码上述果聚糖酶的基因。
[0007]本发明的另一目的是提供包含上述基因的载体。
[0008]本发明的另一目的是提供包含上述基因的菌株。
[0009]本发明的另一目的是提供包含上述基因的宿主细胞。
[0010]本发明所述果聚糖酶为内切β -2，6-果聚糖酶LevAGN25，可得自鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.)，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示或者由具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得。其中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。
[0011]本发明的内切0-2，6-果聚糖酶1^46吧5总共含501个氨基酸，理论分子量为56.4kDa。该酶的最适pH值为6.0，在pH5.0-7.0的范围内维持50%以上的酶活性；经pH5.0- 10.0的缓冲液处理lh，该酶酶活剩余达70%以上；该酶最适温度为55°C，在10°C和20°C分别具有13.5%和32.6%的酶活，在37°C具有约75%的酶活；50°C时该酶的半衰期大于60min，60 °C时半衰期约为IOmin ；在pH6.0及55 °C下，该酶对0.5% (w/v)Levan的比活为219.5±4.2Umg^,而对菊粉、蔗糖、可溶性淀粉、棉籽糖(Raffinose)、水苏糖(Stachyose)、样木木聚糖(Birchwood xylan)、山毛棒木聚糖(Beechwood xylan)、4-0-methyl-d-glucurono-d-xylan、阿拉伯木聚糖(Wheat flour arabinoxylan)、p-nitrophenyl-旦-d-xylopyranoside 及 p-nitrophenyl-a -1-arabinofuranoside 均无酶活；内切Levan生成果寡糖。
[0012]本发明提供了编码上述内切P -2，6-果聚糖酶LevAGN25的基因levAGN25，该基因序列如SEQ ID N0.2所示或者由SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
[0013]本发明通过PCR的方法分离克隆了内切3-2，6-果聚糖酶1^46吧5的编码基因levAGN25，其全长1506bp，起始密码为ATG，终止密码为TAA。经BLAST比对，该内切 @-2，6-果聚糖酶 LevAGN25 与 GenBank 中 Proteiniphilum acetatigenes 来源的糖苷水解酶第32家族蛋白(WP_019540151)具有最高的氨基酸序列一致性，为66.1%。该Proteiniphilum acetatigenes来源的蛋白活性还未研究,只是通过序列相似性归类于糖苷水解酶第32家族蛋白，而糖苷水解酶第32家族包括内切菊粉酶、外切菊粉酶、蔗糖酶及内切P _2，6-果聚糖酶,所以不能通过该Proteiniphilum acetatigenes来源蛋白推导出LevAGN25的活性。以上BLAST比对结果说`明该内切P _2，6-果聚糖酶LevAGN25是一种新的果聚糖酶。
[0014]本发明还提供了包含上述内切@ -2，6-果聚糖酶基因levAGN25的重组载体，优选为pEasy-El-levAGN25。将本发明的内切P _2，6-果聚糖酶基因插入到表达载体中，使其核苷酸序列与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，将本发明的内切^ -2，6-果聚糖酶基因和表达载体pEasy-El通过T-A方式相连接，得到重组大肠杆菌表达质粒 pEasy_El_levAGN25。
[0015]本发明还提供了包含上述内切0-2，6-果聚糖酶基因16^6吧5的重组菌株，优选所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌，优选为重组菌株BL21(DE3)/levAGN250
[0016]本发明制备内切P -2，6-果聚糖酶LevAGN25的方法按以下步骤进行:
[0017]I)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；
[0018]2)培养重组菌株，诱导重组内切@ _2，6-果聚糖酶LevAGN25表达；
[0019]3)回收并纯化所表达的内切P _2，6-果聚糖酶LevAGN25。
[0020]其中，优选所述宿主细胞为大肠杆菌细胞，优选将重组大肠杆菌表达质粒转化大肠杆菌细胞BL21 (DE3)，得到重组菌株BL21 (DE3) /IevAGN25。[0021]本发明提供了一个新的内切β _2，6-果聚糖酶基因，其编码的内切β-2，6_果聚糖酶最适ΡΗ6.0 ;最适温度55°C，在10°C和20°C下分别具有13.5%和32.6%的酶活；经0.1MPH5.0-10.0缓冲液在37°C下处理60min，仍能保持70%以上的活性；50°C时半衰期大于60min ;内切Levan生成果寡糖。本发明的内切β _2，6-果聚糖酶可应用于食品、水产饲料及医疗行业。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为在大肠杆菌中表达的重组内切β -2，6-果聚糖酶LevAGN25的SDS-PAGE分析，其中，M:蛋白质Marker ；S:未纯化的LevAGN25粗酶液;0，60，80，100:分别为O、60、80、IOOmM咪唑洗脱亲和于Nickel-NTA Agarose中的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25 ；
[0023]图2为纯化的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25的pH活性；
[0024]图3为纯化的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25的pH稳定性；
[0025]图4为纯化的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25的热活性；
[0026]图5为纯化的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25的热稳定性；
[0027]图6为纯化的重组内切β _2，6-果聚糖酶LevAGN25在不同时间下水解Levan的产物分析，其中，M:蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖；CK =Levan和失活的LevAGN25 (100°C下处理 IOmin)。
【具体实施方式】
[0028]试验材料和试剂
[0029]1、菌株及载体:鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.),同文献报道菌种性质，如中国普通微生物菌种保藏管理中心菌株CGMCC1.6855 ;大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)和表达载体pEasy-El购于北京全式金生物技术有限公司。
[0030]2、酶类及其它生化试剂:DNA聚合酶和dNTP购自TaKaRa公司；菊粉(Inulin)、样木木聚糖(Birchwood xylan)、山毛棒木聚糖(BeechwoodXy I an )、4-O-methy1-d-gIucurοη ο-d-XyI an、p_nitropheno I (p NP )>p-nitrophenyl-β -d-xylopyranoside 及 p-nitrophenyl-a -1-arabinofuranoside 购自Sigma 公司；阿拉伯木聚糖(Wheat flour arabinoxylan)购自 Megazyme 公司；Levan (来源于 Zymomonas mobilis)购自 Advanced Technology&Industrial 公司；其它都为国产试剂，均可从普通生化试剂公司购买得到。
[0031]3、培养基:
[0032]LB 培养基:PeptonelOg, Yeast extract5g, NaClIOg,加蒸懼水至 1000ml, pH 自然(约为7)。固体培养基在此基础上加2.0% (w/v)琼脂。
[0033]说明:以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验指南》(第三版)J.萨姆布鲁克一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
[0034]实施例1:内切β -2，6-果聚糖酶基因levAGN25的克隆
[0035]提取鞘氨醇杆菌基因组DNA:将液体培养2d的菌液离心取菌体，加入ImL溶菌酶，37°C处理 60min，再加入裂解液，裂解液组成为:50mM Tris, 20mM EDTA, Nacl500mM, 2%SDS(w/v),pH8.0, 70°C水浴裂解 60min,每隔 IOmin 混匀一次，在 4°C下 1000Orpm离心 5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去杂蛋白，再取上清加入等体积异丙醇，于室温静置5min后，4°C下1000Orpm离心lOmin。弃上清,沉淀用70%的乙醇洗漆两次,真空干燥,加入适量TE溶解，置于-20°C备用。
[0036]根据专利(专利号:ZL201210062425.6)中的外切菊粉酶基因Z2-5，设计热不对称交错PCR (简称TAIL-PCR)上游特异性引物4条，并将它们分别命名为uspl (碱基序列如SEQ ID N0.3所示)、usp2 (碱基序列如SEQ ID N0.5所示)、usp3 (碱基序列如SEQ ID N0.6所示)、usp4 (碱基序列如SEQ ID N0.7所示)，参见表1，表1为内切(6-2, 6-果聚糖酶基因levAGN25的克隆与表达引物。特异性引物设计方向为需要扩增的未知区域方向，usp2的位置设计在uspl的内侧，usp4的位置设计在usp3的内侧。以鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，TAIL-PCR反应参数参照文献(Zhou JPet al., Appl Biochem Biotech2010, 160:1277 - 1292)，特异性引物退火温度在 50 - 60°C。扩增产物送北京六合华大基因科技股份有限公司广州分公司测序。测序结果与已知基因序列片段相拼接，得到专利(专利号:ZL201210062425.6)中的外切菊粉酶基因Z2-5的全基因外部上游序列。该上游序列经读码框分析后得到本专利内切(6-2, 6-果聚糖酶基因levAGN25，该基因序列如SEQ ID N0.2所示，未包含任何基因Z2-5中的碱基。 [0037]实施例2:重组内切P -2，6-果聚糖酶LevAGN25的制备
[0038]以levAGN25F (碱基序列如SEQ ID N0.7所示)和levAGN25R (碱基序列如SEQ IDN0.8所示)为引物对，参见表1，表1为内切(6-2, 6-果聚糖酶基因levAGN25的克隆与表达引物，鞘氨醇杆菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应参数为:94°C变性5min ;然后94°C变性 30sec，50°C退火 30sec，72°C延伸 lmin30sec，30 个循环后 72°C保温 lOmin。PCR结果得到内切(6-2, 6-果聚糖酶基因levAGN25，并在该基因3’端引入突出的A碱基。将内切@ -2，6-果聚糖酶基因levAGN25和表达载体pEasy-El通过T-A方式相连接，获得含有levAGN25 的重组表达质粒 pEasy_El_levAGN25。将 pEasy_El_levAGN25 转化大肠杆菌 BL21(DE3)，获得重组大肠杆菌菌株BL21 (DE3)/levAGN25。
[0039]表1内切@ -2，6-果聚糖酶基因levAGN25的克隆与表达引物
【权利要求】
1.一种果聚糖酶，其特征在于，其具有(I)或(II)所示的氨基酸序列中任意一个: (I)具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列； (II)具有SEQID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的果聚糖酶的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N0.2所示或者由SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个碱基获得。
4.包含权利要求2或3所述基因的重组载体。
5.含有权利要求4或5所述载体的宿主细胞。
6.包含权利要求2或3所述基因的菌株。
7.根据权利要求6所述的菌株，其特征在于，所述菌株为重组菌株。
8.根据权利要求7所述的菌株，其特征在于，所述菌株为大肠杆菌、酵母菌、芽孢杆菌或乳酸杆菌。`
【文档编号】C12N1/21GK103667208SQ201310711448
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月20日 优先权日:2013年12月20日
【发明者】黄遵锡, 周峻沛, 高雅洁, 张蕊, 唐湘华, 李俊俊, 许波, 丁俊美 申请人:云南师范大学