一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体snj1的鉴定方法
【专利摘要】一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJ1的鉴定方法，该方法先将待检测嗜盐古生菌涂布在固体培养基上培养5～7d以形成单菌落，再将单菌落接种至上层含有指示菌的双层平板上恒温培养2d，最后观察双层平板上是否形成噬菌斑。本发明无需对单菌落进行增殖培养并使噬菌体与宿主细胞分离即可对噬菌体进行鉴定，不仅缩短了鉴定周期，而且简化了鉴定步骤，降低了成本。
【专利说明】一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJ1的鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种噬菌体的鉴定方法，具体涉及一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，适用于缩短鉴定周期、简化鉴定工序、降低成本。
【背景技术】
[0002]嗜盐古生菌生活在高盐(1.5~5M)的环境中，包括一些盐湖和盐厂，在一些盐浓度接近饱和(约为35%w/v)的环境中，嗜盐古生菌依然以较高的密度存在(约为108cell/
ml).
[0003]噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称，作为病毒的一种，噬菌体具有病毒特有的一些特性:个体微小，不具有完整细胞结构，只含有单一核酸。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是在细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。作为整个生态系统的一个重要组成部分，噬菌体在基因的转移、生物的进化等方面展示了重要的意义。同时，噬菌体在遗传学方面的研究以及分子生物学等方面的研究都起到了十分重要的作用。据统计，目前大约已有5450株的病毒被分离、报道。但是，截至到目前为止，仅有不超过30株的嗜盐古生菌噬菌体被分离。
[0004]在噬菌体与宿主长期共存的环境中，溶源与裂解是两种常见的相互作用形式。溶源是指温和噬菌体在吸附和侵入宿主细胞后，将噬菌体基因组整合在宿主细胞染色体上，随宿主DNA复制而同步复制，随宿主细胞分裂而传递到两个子细胞中，宿主细胞可正常繁殖，以上过程称为“溶源周期”，但在一定条件下，噬菌体基因组可进行复制，产生并释放子代噬菌体，即“裂解周期”。裂解是指烈性噬菌体在宿主细胞内能够完成增殖过程，产生并释放大量子代噬菌体并裂解宿主细胞。但在对嗜盐古生菌及其噬菌体的研究中发现，除了上述溶源与裂解外，二者还有一类假溶源存在形式。简单的说，假溶源就是指噬菌体基因组在进入宿主细胞后，噬菌体的DNA不整合到宿主的染色体上，而是以质粒的形式独立存在，随着宿主的生长不断的向周围环境中释放噬菌体子代而宿主自身不裂解。
[0005]嗜盐古生菌假溶源性噬菌体通常采用以下方法进行鉴定:首先将待检测嗜盐古生菌涂布在固体培养基上培养以形成单菌落，此过程大约5~7d，然后分别挑选单菌落至盛有新鲜的液体培养基的试管中培养3~4d，再取一定量的液体培养物离心，并用移液器取2~3 μ L上清液滴在倒好的双层平板上(双层平板的上层含有指示菌)，然后放到恒温箱中培养2d，之后观察是否在双层平板上形成透明的噬菌斑。整个鉴定过程大约耗时10~13d，不仅鉴定周期较长，而且鉴定工序较复杂，成本较高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术中存在的鉴定周期较长，鉴定工序较复杂，成本较高的问题，提供一种鉴定周期较短、简单易行、成本较低的嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法。
[0007]为实现以上目的，本发明提供了以下技术方案:
[0008]一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，该方法依次包括以下步骤:
[0009]步骤一:一号培养基、二号培养基的配置:
[0010]所述一号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到一号培养基；
[0011]所述二号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到二号培养基；
[0012]步骤二:待测嗜盐古生菌的培养:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固后在其上均匀涂布待测嗜盐古生菌，再将涂布有待测嗜盐古生菌的一号培养基于42~45°C培养至形成单菌落；
[0013]步骤三:双层平板的制备:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固干燥后，将培养到对数期的指示菌液与42~45°C下的二号培养基混合均匀以形成混合培养液，然后将该混合培养液倒入一号培养基上，并使混合培养液凝固以形成双层平板，其中，所述指示菌为Natrinema sp.J7-2嗜盐古生菌，所述指示菌液的体积为300 μ L，二号培养基的体积为4.7~5mL ；
[0014]步骤四:噬菌体的鉴定:将步骤二中形成的单菌落接种到双层平板上，并于42~45°C下恒温培养2d后观察双层平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内寄宿有假溶源性噬菌体SNJ1，若未形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内未寄宿假溶源性噬菌体SNJ1，此时，嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定完成。
[0015]步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，然后挑取单菌落直接移殖到双层平板上的等分区块内。
[0016]步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，再挑取单菌落并将其加入到20 μ L液体培养基中混合均匀，然后取6 μ L混有单菌落的液体培养基滴加到双层平板上的等分区块内，其中，所述液体培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后将该混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到液体培养基。
[0017]步骤四中，所述接种是指采用影印法将单菌落影印到双层平板上。
[0018]步骤二中，所述待测嗜盐古生菌的培养时间为5~7d。
[0019]与现有技术相比，本发明的有益效果为:
[0020]1、本发明一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法先将待检测嗜盐古生菌涂布在固体培养基上培养以形成单菌落，再将单菌落接种至上层含有指示菌的双层平板上恒温培养，最后观察噬菌斑的形成状况，用时7~9d，与常规鉴定方法相比，该法省略了对单菌落进行液体培养并离心获得噬菌体的步骤，无需将噬菌体与宿主细胞分离即可对其进行鉴定，不仅缩短了鉴定周期，而且简化了鉴定步骤，降低了成本。因此，本发明不仅缩短了鉴定周期，而且简化了鉴定步骤，降低了成本。
[0021]2、本发明一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法中噬菌体的鉴定步骤采用影印法将单菌落接种到双层平板上，该法可同时完成将多个单菌落从一个平板移殖到另一平板上的接种任务，不仅节约了接种时间，而且有效降低了批量鉴定的工作量。因此，本发明有效降低了批量鉴定的工作量。
【具体实施方式】
[0022]下面结合【具体实施方式】对本发明作进一步的说明。
[0023]一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，该方法依次包括以下步骤:
[0024]步骤一:一号培养基、二号培养基的配置:
[0025]所述一号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到一号培养基；
[0026]所述二号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到二号培养基；
[0027]步骤二:待测嗜盐古生菌的培养:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固后在其上均匀涂布待测嗜盐古生菌，再将涂布有待测嗜盐古生菌的一号培养基于42~45°C培养至形成单菌落；
[0028]步骤三:双层平板的制备:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固干燥后，将培养到对数期的指示菌液与42~45°C下的二号培养基混合均匀以形成混合培养液，然后将该混合培养液倒入一号培养基上，并使混合培养液凝固以形成双层平板，其中，所述指示菌为Natrinema sp.J7-2嗜盐古生菌，所述指示菌液的体积为300 μ L，二号培养基的体积为4.7~5mL ；`
[0029]步骤四:噬菌体的鉴定:将步骤二中形成的单菌落接种到双层平板上，并于42~45°C下恒温培养2d后观察双层平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内寄宿有假溶源性噬菌体SNJ1，若未形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内未寄宿假溶源性噬菌体SNJ1，此时，嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定完成。
[0030]步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，然后挑取单菌落直接移殖到双层平板上的等分区块内。
[0031]步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，再挑取单菌落并将其加入到20 μ L液体培养基中混合均匀，然后取6 μ L混有单菌落的液体培养基滴加到双层平板上的等分区块内，其中，所述液体培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后将该混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到液体培养基。
[0032]步骤四中，所述接种是指采用影印法将单菌落影印到双层平板上。
[0033]步骤二中，所述待测嗜盐古生菌的培养时间为5~7d。
[0034]本发明的原理说明如下:
[0035]本发明以对假溶源性噬菌体SNJl敏感的Natrinema sp.J7-2嗜盐古生菌(该菌株于1997年保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCN0.AB91141)作为指示菌，由于假溶源性噬菌体SNJl会随着宿主的生长不断的向周围环境中释放噬菌体子代，因此本发明利用假溶源性噬菌体SNJl的该特性直接将其连同宿主细胞接种至上层含有指示菌的双层平板上恒温培养，观察噬菌斑的形成状况，无需对单菌落进行增殖培养并使噬菌体与宿主细胞分离即可对噬菌体进行鉴定，是一种简便快速、且成本较低的鉴定方法。
[0036]本发明中噬菌体的鉴定步骤采用影印法将单菌落接种到双层平板上，无需单独挑取每个单菌落后接种到相应的等分区块内，可同时完成多个菌落从一个平板转移到另一平板上的接种任务，有利于批量鉴定。
[0037]本发明方法也同样适用于其他假溶源性噬菌体的鉴定。
[0038]实施例1:[0039]一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，该方法依次包括以下步骤:
[0040]步骤一:一号培养基、二号培养基的配置:
[0041]所述一号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物，再将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到一号培养基；
[0042]所述二号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到二号培养基；
[0043]步骤二:待测嗜盐古生菌的培养:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固后在其上均匀涂布待测嗜盐古生菌，再将涂布有待测嗜盐古生菌的一号培养基于42~45°C培养5~7d以形成单菌落；
[0044]步骤三:双层平板的制备:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固干燥后，再将培养到对数期的指示菌液与42~45°C下的二号培养基混合均匀以形成混合培养液，然后将该混合培养液倒入一号培养基上，并使混合培养液凝固以形成双层平板，其中，所述指示菌为Natrinema sp.J7-2嗜盐古生菌,所述指示菌液的体积为300 μ L, 二号培养基的体积为4.7~5mL ;
[0045]步骤四:噬菌体的鉴定:将步骤二中形成的单菌落接种到双层平板上，并于42~45°C下恒温培养2d后观察双层平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内寄宿有假溶源性噬菌体SNJ1，若未形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内未寄宿假溶源性噬菌体SNJ1，此时，嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定完成，其中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，然后挑取单菌落直接移殖到双层平板上的等分区块内。
[0046]本实施方法的检出率为93%。
[0047]实施例2:
[0048]步骤与实施例1基本相同，不同之处在于:
[0049]步骤一中，二号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂4g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,然后将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到二号培养基。
[0050]本实施方法的检出率为96%。
[0051]实施例3:
[0052]步骤与实施例1基本相同，不同之处在于:[0053]步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，再挑取单菌落并将其加入到20 μ L液体培养基中混合均匀，然后取6 μ L混有单菌落的液体培养基滴加到双层平板上的等分区块内，其中，所述液体培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液，然后将该混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到液体培养基。
[0054]本实施方法的检出率为100%。
[0055]实施例4:
[0056]步骤与实施例1基本相同，不同之处在于:
[0057]步骤四中，所述接种是指采用影印法将单菌落影印到双层平板上。
[0058]本实施方法的检 出率为92%。
【权利要求】
1.一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，其特征在于该方法依次包括以下步骤: 步骤一:一号培养基、二号培养基的配置: 所述一号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂10~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,再将该固液混合物于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到一号培养基； 所述二号培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g、琼脂4~15g并加水混合定容至1000mL以形成固液混合物,再将该固液混合物于0.69X 105Pa、100~125°C下灭菌10~60min以得到二号培养基； 步骤二:待测嗜盐古生菌的培养:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固后在其上均匀涂布待测嗜盐古生菌，再将涂布有待测嗜盐古生菌的一号培养基于42~45°C培养至形成单菌落； 步骤三:双层平板的制备:先向平皿中倒入一号培养基，待一号培养基凝固干燥后，将培养到对数期的指示菌液与42~45°C下的二号培养基混合均匀以形成混合培养液，然后将该混合培养液倒入一号培养基上，并使混合培养液凝固以形成双层平板，其中，所述指示菌为Natrinema sp.J7-2嗜盐古生菌，所述指示菌液的体积为300 μ L，二号培养基的体积为 4.7 ~5mL ； 步骤四:噬菌体的鉴定:将步骤二中形成的单菌落接种到双层平板上，并于42~45°C下恒温培养2d后观察双层平板上是否形成噬菌斑，若形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内寄宿有假溶源性噬菌体SNJ1，若未形成噬菌斑则表明待测嗜盐古生菌内未寄宿假溶源性噬菌体SNJ1，此时，嗜盐古生菌假溶源性噬菌体S`NJl的鉴定完成。
2.根据权利要求1所述的一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，其特征在于:步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，然后挑取单菌落直接移殖到双层平板上的等分区块内。
3.根据权利要求1所述的一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，其特征在于:步骤四中，所述接种是指先在平皿的背面划分多个等分区块，再挑取单菌落并将其加入到20 μ L液体培养基中混合均匀，然后取6 μ L混有单菌落的液体培养基滴加到双层平板上的等分区块内，其中，所述液体培养基的配置方法为:先称取NaC1250g、MgCl2.6H2030g、酵母粉2g、乳清蛋白水解物2.5g并加水混合定容至1000mL以形成混合溶液,然后将该混合溶液于0.69 X IO5PaUOO~125°C下灭菌10~60min以得到液体培养基。
4.根据权利要求1所述的一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，其特征在于:步骤四中，所述接种是指采用影印法将单菌落影印到双层平板上。
5.根据权利要求1~4中任一项所述的一种嗜盐古生菌假溶源性噬菌体SNJl的鉴定方法，其特征在于:步骤二中，所述待测嗜盐古生菌的培养时间为5~7d。
【文档编号】C12Q1/70GK103695564SQ201310731028
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月26日 优先权日:2013年12月26日
【发明者】梅运军, 何聪聪, 胡纯, 张顺喜, 黄咏驰 申请人:武汉轻工大学