一种快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸,该试纸是由吸水垫(1)、NC膜（2）、金标结合垫（3）、样品吸液层（4）、检测线（5）、质控线（6）和底板（7）组成；吸水垫(1)、NC膜（2）、金标结合垫（3）、样品吸液层（4）自右向左依次粘贴在底板（7）上，NC膜（2）上设有检测线（5）和质控线（6），检测线（5）位于质控线（6）的左侧。本实用新型的试纸中利用核酸适体代替了传统抗体，制备更为简便，节约成本，结果显示形象直观准确，可用于现场操作，无需任何其他试剂和仪器，保存方便，有效期长，易推广应用。
【专利说明】一种快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及农药残留检测【技术领域】，尤其涉及一种快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸。
【背景技术】
[0002]西维因是一种广谱高效低毒的氨基甲酸酯类杀虫剂，其应用是注册范围最广的杀虫剂，其被广泛应用于对蔬菜、棉花、粮食的杀虫，果树上作为疏花剂，水产养殖中可为鱼塘去除有害生物。但是随着农业经济的发展，由于农药使用不当，在蔬菜、牧草和农作物上都可能会大量的残留，动物进食了含有农药的饲料或者饮用水都可能中毒，积累大量的农药在体内。大量农药的应用还会导致土壤环境中农药含量超标，对人类的生存环境产生了严重的危害。目前，对其检测的方法主要有气相和液相色谱法、超高效液相色谱串联质谱法、薄层色谱法等，这些方法技术很成熟，但是前处理复杂，不利于实现快速检测。
[0003]西维因的分子量为200，为小分子化合物，本身不具有免疫原性。因此，制备抗体需要通过与大分子蛋白质交联才能成为免疫原，过程繁琐，且抗体的质量受抗原影响很大。核酸适体是一种比抗体具有更高特异性的配基，其体外筛选、体外制备的特点能够有效克服抗体制备周期长、生产成本高、技术难度大、批间差异大、克隆株不易有效保存的缺点，并且核酸适体开发周期短、生产成本低、使用方便在检测分析领域中的应用已经被广泛认可，因此，核酸适体在西维因的快速检测中具有良好的应用前景。
实用新型内容
[0004]本实用新型的目的在于针对免疫层析过程中抗体制备繁琐的不足提供一种制备简单、灵敏度高、成本低、操作简单、检测时间短的试纸。
[0005]本实用新型的快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸是由吸水垫、NC膜、金标结合垫、样品吸液层、检测线、质控线和底板组成；吸水垫、NC膜、金标结合垫、样品吸液层自右向左依次粘贴在底板上，NC膜上设有检测线和质控线，检测线位于质控线的左侧。
[0006]金标结合垫的五分之四区域覆盖在样品吸液层下方。
[0007]金标结合垫上含有经生物素标记的含有西维因适体组装的纳米颗粒聚集体。
[0008]检测线中含有生物素标记的适体互补序列。
[0009]质控线中含有链亲和素。
[0010]样品吸液层是由玻璃棉或聚酯制成。
[0011]金标结合垫是由纤维或玻璃棉制成。
[0012]底板是由不吸水的硬质材料制成。
[0013]底板优选是由PVC制成。
[0014]本实用新型试纸由吸水垫、NC膜、金标结合垫、样品吸液层顺次粘贴在底板上组成，金标结合垫不是完全覆盖在样品吸液层下，优选金标结合垫的五分之四区域覆盖于样品吸液层之下，可以将检测液体充分吸收后与金标适体反应，再层析至NC膜上进行反应，可以有效减少误差。
[0015]所述NC膜上有互补序列构成的隐形检测线(经生物素标记)，以及由链亲和素形成的隐形质控线。
[0016]本实用新型试纸的底板可为PVC板或其他硬质而不吸水的材料；金标结合垫由纤维或玻璃棉制成；样品吸液层由玻璃棉或聚酯材料制成。
[0017]在NC膜上的检测线和质控线相互平行且与样品流动方向垂直。
[0018]当该试纸条用来检测样品时，把试纸条浸入处理过的样品液中，样品由于毛细作用进行侧向层析，首先进过金标区，将生物素标记的金标适体复溶，然后一起进行侧向层析。当经过NC膜上的显色检测区时，金标适体会和检测线上的互补序列及质控线上的链亲和素结合，而适体与西维因的结合力大于其与互补序列的，因而使得适体不能和检测线上的互补序列不能配对结合，使得条带颜色呈现深浅不同的红色，之后金标适体会继续层析与质控线上的链亲和素结合显色，确定试纸条的结果可信。
[0019]本实用新型试纸具有如下有益效果:
[0020]1、灵敏度高。西维因快速检测试纸以胶体金标记高亲和力的适体为基础制备而成，以特异性适体建立起的西维因快速筛查技术最低能够检测出浓度约为0.8 mg/L的西维因。
[0021]2、操作简便快速。使用快速检测试纸只需将试纸插入样品液中，5分钟左右显示结果O
[0022]3、显示结果形象、直观准确。快速检测试纸以显示红线“ I ”和“ I I ”印迹作为检测的阳性和阴性标记。样品中西维因的含量与检测线的颜色呈反相关，样品中西维因含量越高，检测线的颜色越浅。
[0023]4、成本低。使用快色检测试纸条，在不需要另配仪器的情况下，就可直接判定待测物的有无，使现场检测一步到位。且适体的筛选过程避免了动物免疫，筛选过程简便，后期制备也只需要化学合成，不需要制备腹水，制作周期和成本都远低于抗体。
[0024]5、易于大范围推广应用。快速检测试纸操作简单，不需要专业培训，能较好的满足不同层次人员的需要，如检测部门的现场检测、个体种植户、大型批发市场及超市的进场检测，甚至是普通市民在瓜果蔬菜食用前对其检测，该实用新型具有广阔的市场前景和较大的社会、经济效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0025]图1是本实用新型的检测西维因残留量的胶体金试纸的结构示意图
[0026]1、吸水垫；2、NC膜；3、金标结合垫；4、样品吸液层；5、检测线；6、质控线；7、底板。
[0027]图2是本实用新型的试纸检测原理的示意图
[0028]【具体实施方式】
[0029]下面的实施例是对本实用新型的进一步详细描述。
[0030]如图1所示本实用新型的检测西维因残留的胶体金试纸由吸水垫1、、金标结合垫
3、样品吸液层4顺次粘贴在底板7上，NC膜2上设有检测线5和质控线6。
[0031]要制成西维因快色检测试纸条首先需要筛选西维因适体，制备检测线上的互补序列，制备胶体金用于制备金标适体，在整个制备过程中都不需要对西维因农药进行改造和修饰，相比于免疫胶体金层析技术极大地简化了制备过程。以下是相关材料的制备方法:
[0032]1、运用SELEX技术筛选抗西维因适体
[0033]本实用新型中用荧光素(FAM)将随机寡聚核苷酸库进行标记，每轮筛选的PCR扩增用FAM标记的上游引物进行，通过比较筛选时投入样品和洗脱样品的荧光强度来判断筛选效率。SELEX具体过程如下:
[0034](I)杂交:将随机库以及封闭序列溶入200 UL IXSB缓冲液中后，先90°C变性3min再于4°C条件下孵育过夜(测定荧光强度)；
[0035](2)固定:取200 μ L链亲和素修饰的琼脂糖凝胶用IXSB洗涤5次(200 μ L/次)，再将过夜孵育的溶液加入，于室温条件下在旋转混合器上作用30 min ；
[0036](3 )洗涤:用I X SB快速洗涤上述凝胶5次(200 μ L/次)；
[0037](4)负筛选:加入200 μ LlXSB到上述洗涤过的凝胶中，于室温条件下在旋转混合器上作用I h后离心(500 g离心I min,下同)；
[0038](5)洗脱:加入200 μ L浓度为0.5 mmol/L的西维因溶液(I X SB做溶剂)，于室温条件下在旋转混合器上作用I h后离心并收集下清滤液(测荧光强度)；
[0039](6) PCR 扩增；
[0040](7)双链DNA 拆分:拆分产物用微量紫外可见分光光度计定量测定后用于进入下一轮筛选。
[0041]后续筛选过程除以下条件外，其他所有条件均与第一轮筛选基本相同。快速洗涤的次数增加为10次；负筛选和洗脱作用时间降为30 min。当筛选效率不再上升时停止筛选，扩增产物经乙醇沉淀(加入少量糖原做助沉剂)后备用。
[0042]2、TA 克隆
[0043]TA克隆选用TA克隆试剂盒(pUC-T Simple Cloning Kit)进行，TA克隆后随机挑取白色菌落进行PCR鉴定和测序鉴定。
[0044](I)连接:将载体、最后一轮筛选的PCR产物、ddH20以及Buffer混合后于22 °C条件下孵育30 min进行连接；
[0045](2)转化:将上述连接产物加入至50 μ L感受态细胞中，冰浴30 min后42 °〇热击45 s,最后再冰浴I min ；
[0046](3)培养:将上述溶液加入到450 μ L SOC培养基中，于37°C、250 r/min条件下振荡培养I h ；
[0047](4)蓝白斑筛选:将培养好的菌液涂布在LB/Amp/X-Gal/IPTG平板上，37 °C培养过夜后随机挑取20个白色菌落至I mL SOC培养基中进行培养；
[0048](5) PCR 鉴定；
[0049](6)测序鉴定:对PCR鉴定为阳性的克隆作进一步测序鉴定。并将测序成功的序列进行合成，修饰硫醇基团，以供下一步试纸条组装使用。
[0050]3、生物素标记单链DNA
[0051]生物素溶于0.01mM PB缓冲液中(pH7.4)，使其终浓度为lmg/mL。取5 μ L生物素水溶液和35 μ L单链DNA (适体/互补序列)混合,在4°C下混合2h后6000rpm离心30min,去上清，重复两次后，沉淀用PB悬浮。
[0052]4、胶体金的制备[0053](I)在洁净的烧杯中加入IOOmL的0.01%的氯金酸水溶液，加热至沸腾；
[0054](2)边搅拌边加入1%柠檬酸三钠谁溶液1.8mL,继续煮沸lOmin，体系颜色由金黄色逐渐变黑又变为酒红色；
[0055](3)静置冷却后，用去离子水回复原体积，制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
[0056]5、胶体金标记
[0057]胶体金颗粒在1000Orpm转速下离心15min，去离子水复溶，硫醇基团修饰的适体与胶体金溶于按1:1(v/v)在室温下反应8h，加入2m NaCl使其终浓度为50mM再反应12h。混合液在6500rpm转速下离心15min，复溶后吸附于纤维材料上，干燥后使用。
[0058]6、西维因快速检测试纸实施检测原理
[0059]把试纸的样品吸液层端插入果汁、蔬菜浸出液中，Imin后取出，由于毛细作用进行侧向层析，5-10min观察结果。
[0060]7、结果判断:检测西维因浓度lmg/mL以上，NC膜上出现一条红线为阳性；lmg/mL以下出现双红线为阴性；lmg/mL时检测线处为一条模糊阴影线为界限值。
[0061]尽管已经示出和描述了本实用新型的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本实用新型的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本实用新型的范围由所附权利要求及其等同物限定。
【权利要求】
1.一种快速检测西维因农药残留的适体胶体金试纸，其特征在于:该试纸是由吸水垫(I)、NC膜(2)、金标结合垫(3)、样品吸液层(4)、检测线(5)、质控线(6)和底板(7)组成；吸水垫(I)、NC膜(2)、金标结合垫(3)、样品吸液层(4)自右向左依次粘贴在底板(7)上，NC膜(2 )上设有检测线(5 )和质控线(6 )，检测线(5 )位于质控线(6 )的左侧。
2.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于:金标结合垫(3)的五分之四区域覆盖在样品吸液层(4)下方。
3.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于:样品吸液层(4)是由玻璃棉或聚酯制成。
4.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于:金标结合垫(3)是由纤维或玻璃棉制成。
5.如权利要求1所述的胶体金试纸，其特征在于:底板(7)是由不吸水的硬质材料制成。
6.如权利要求5所述的胶体金试纸，其特征在于:底板(7)是由PVC制成。
【文档编号】C12M1/00GK203569071SQ201320480094
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2013年8月7日 优先权日:2013年8月7日
【发明者】周骏贵, 王耘, 张驰, 杨军, 凌睿 申请人:南京市产品质量监督检验院