食源性致病菌定量检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型涉及一种食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是：包括盒体、盒盖和若干个发酵增菌容器，所述盒体内均匀排列发酵增菌容器，所述发酵增菌容器内设有集气窗，所述集气窗前端与发酵增菌容器内前壁固接，集气窗末端与发酵增菌容器内底部固接，所述集气窗横向截面形状呈开口矩形，其纵向截面形状呈直角三角形，所述集气窗与发酵增菌容器固接后，在发酵增菌容器的底部呈坡度的气泡收集空间。有益效果：通过致病菌定量检测的数目可以定量评价检测目标的污染程度是否达到安全限量标准，为食品安全致病菌检测提供了可靠的数据。可广泛应用于食品、自来水、纯净水、饮料、制药、保健品、化妆品、疾病预防控制、出入境检疫局等十余个行业。
【专利说明】 食源性致病菌定量检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型属于食品检测，尤其涉及一种直接应用于食品、饮用水的食源性致病菌定量检测试剂盒。
【背景技术】
[0002]2012年食源性致病菌检测手册中对部分致病菌由原有的定性检测方法重新修订为定量检测方法。即，对食品中大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、阪崎肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌等致病菌、采用九管定量检测，即九管发酵法(MPN)检测方法。其培养基载体为液体培养基，检测程序多达六个步骤:试剂配制、分装、消毒、检测、洗涤、烘烤。该方法检测成本高、检测周期长，检验方法及操作程序繁杂。专利申请号:201010550133.8公开了一种对食品中的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和志贺氏菌进行同时快速检测的多重荧光定量PCR方法，其特征是由以下步骤构成:(I)应用一定配比的含7.5%氯化钠肉汤和GN的混合培养基对含有上述致病菌的食品进行快速同时增菌，并使用离心柱式细菌基因组DNA提取试剂盒提取培养液中的细菌基因组总DNA ; (2)应用根据沙门氏菌的复制原点C基因、金黄色葡萄球菌的Nuc基因、志贺氏菌的IpaH基因设计的扩增引物和Taqman探针对上述细菌基因组总DNA进行多重荧光定量PCR同时检测，并使用自行设计的重组DNA片段作为阳性内参监控反应体系，根据分别代表三种致病菌的荧光信号在一定循环数内是否出现显著扩增判定食品中是否存在上述致病菌。该方法手段复杂、检测周期很长。专利申请号:201010556679.4公开了一种快速检测婴幼儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的PCR方法，其特征是包括以下几个步骤:(I)阪崎肠杆菌的培养；(2)制备阪崎肠杆菌基因组DNA ； (3)构建阪崎肠杆菌重组质粒,作为标准品绘制标准曲线进行定量；(4)构建ompA内标重组质粒，与目的基因在同一反应体系内同时扩增，监测反应体系，排除假阴性；(5)建立分子信标荧光定量技术检测婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌的方法，优化反应条件；(6)对3种从婴儿配方奶粉中高效提取阪崎肠杆菌的方法进行比较；(7)确定分子信标荧光定量方法的灵敏度；(8)人工污染样品，确定检测限；(9)实际检测，确定该方法的特异性、灵敏度、符合率。该方法只针对阪崎肠杆菌的检测，只能定性分析，不能满足食源性致病菌检测手册中有关“定量检测”的规定。食品检测部门亟待开发一种可以一目了然观察检测目标细菌的生长繁殖过程，对检测目标致病菌检测的数目可以定量评价的检测装置和方法。
实用新型内容
[0003]本实用新型的目的在于克服上述技术的不足，而提供一种食源性致病菌定量检测试剂盒，采用定量检测方法，通过培养基包被技术，将食源性致病菌相对应的培养基包被在无色透明的试剂盒载体上，检测目标致病菌检测的数目可以定量评价，为食品安全提供了检测目标的污染程度是否达到安全限量标准。
[0004]本实用新型为实现上述目的，采用以下技术方案:一种食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是:包括盒体、盒盖和若干个发酵增菌容器，所述盒体内均匀排列发酵增菌容器，所述发酵增菌容器内设有集气窗，所述集气窗前端与发酵增菌容器内前壁固接，集气窗末端与发酵增菌容器内底部固接，所述集气窗横向截面形状呈开口矩形，其纵向截面形状呈直角三角形，所述集气窗与发酵增菌容器固接后，在发酵增菌容器的底部呈坡度的气泡收集空间。
[0005]所述盒体、盒盖和发酵增菌容器均为无色透明体，采用能够降解的材料制成。
[0006]所述发酵增菌容器数量为十个，发酵增菌容器在盒体中前后排列各五个。
[0007]所述发酵增菌容器观测面的侧壁上设有试验标识刻线。
[0008]有益效果:与现有技术相比，本实用新型提供了一种省去了实验前的大量准备工作，方便、快捷、准确的定量测试食源性致病菌的装置。由原来的定性检测逐步改为定量检测，通过上述致病菌定量检测的数目的多少可以定量评价以上检测目标的污染程度是否达到安全限量标准，为食品安全致病菌检测提供了可靠的数据。本试剂盒通过培养基包被技术，将培养基包被在无色透明的试剂盒载体上，本试剂盒提高了试验准确性和标准化程度，简化了操作程序，缩短检验时间，减轻了工作强度，减少了试验耗材，提高了工作效率。本试剂盒为一次性无菌用品，可降解再生，避免污染。可广泛应用于食品行业、自来水公司、纯净水行业、饮料行业、制药行业、保健品行业、化妆品行业、疾病预防控制系统、出入境检疫局、技术监督部门、环境保护行业、工商管理部门等十余个行业。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1是本实用新型的结构示意图；
[0010]图2是图1中集气窗的纵向截面剖视图。
[0011]图中:1、盒体，2、盒盖，3、发酵增菌容器，4、集气窗，5、试验标识刻线。
【具体实施方式】
[0012]下面结合较佳实施例详细说明本实用新型的【具体实施方式】。
[0013]实施例
[0014]详见附图，一种食源性致病菌定量检测试剂盒，包括盒体1、盒盖2和若干个发酵增菌容器3，所述盒体内均匀排列发酵增菌容器，本实施例的发酵增菌容器数量为十个，发酵增菌容器在盒体中前后对应排列各五个，第1-9个发酵增菌容器为试验检测容器，第10个发酵增菌容器为试验检测对照容器。所述发酵增菌容器内设有集气窗4，所述集气窗前端与发酵增菌容器内前壁固接，集气窗末端与发酵增菌容器内底部固接，所述集气窗横向截面形状呈开口矩形，其纵向截面形状呈直角三角形，所述集气窗与发酵增菌容器固接后，在发酵增菌容器的底部呈坡度的气泡收集空间，例如:大肠埃希氏、阪崎肠杆菌主要的生化反应是产酸产气，而产气是判定这两个致病菌的是与否的重要指标之一，通过固定的集气窗直接观察其大肠埃希氏、阪崎肠杆菌产气情况，对其致病菌的判定起到了重要作用。所述发酵增菌容器观测面的侧壁上设有试验标识刻线5，每个发酵增菌容器的试验标识刻线是符合试验要求的9mL、10mL的试验标线。
[0015]本实用新型的优选方案是:所述盒体、盒盖和发酵增菌容器均为无色透明体，采用能够降解的材料制成，为一次性无菌用品，可降解再生，避免污染。
[0016]使用方法:[0017]本试剂盒可以实现2012年食源性致病菌检测手册中规定的定量检测方法。试剂盒培养基的包被:与2012年食源性致病菌检测手册中所规定的，大肠艾希氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、创伤弧菌、阪崎肠杆菌、单核细胞增生李斯特菌、沙门氏菌定量检测中所应用的培养基相同。事先将浓缩月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基、亚硒酸盐胱氨酸增菌液、10%氯化钠胰蛋白胨肉汤培养基、3%碱性蛋白胨水、李氏增菌肉汤(LBI )、改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素培养基包被在试剂盒中，随时取用。通过培养基包被技术，将上述致病菌相对应的培养基包被放在无色透明的试剂盒载体内。
[0018]大肠埃希氏菌的定量检测
[0019]试剂盒使用说明书
[0020]I适用范围:适用于食源性致病菌大肠埃希氏菌定量(MPN)方法的检测。
[0021]2方法原理:依据《2012年食源性致病菌监测工作手册》中的定量检验方法，采用包被技术，将月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤培养基包被在试剂盒底部，随时取用，省去了实验前的大量准备工作，方便、快捷。
[0022]3试剂盒的组成:试剂盒由5个发酵增菌容器前后对应并排共10个发酵增菌容器组成，第1-9发酵增菌容器为试验盒，第10发酵增菌容器为试验对照盒。用前加入无菌蒸馏水或无菌生理盐水至盒的标线处即为IOmL月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基。
[0023]4操作步骤
[0024]4.1样品制备:以无菌操作称取检样25g(mL)，加入225mL磷酸盐缓冲液或无菌生理盐水中制备成1:10的均匀样品稀释液。
[0025]4.2增菌培养:
[0026]4.2.1试剂盒的准备:打开盒盖，试剂盒1-10发酵增菌容器中加入无菌盐水9~IOmL即可，备用；
[0027]4.2.2加样:选择上述样品匀液三个连续的适宜稀释度，接种到含有月桂基硫酸盐胰蛋白胨培养基的发酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)，每个稀释度接种3盒，每盒接种lmL。第10发酵增菌容器不加样液为阴性对照，于36°C ± 1°C培养48h±2h ;
[0028]4.3分离培养:对所有浑浊生长，集气窗有气泡产生的试剂盒增菌液，用接种环移取I环，接种EC肉汤培养基中，培养24h，检查试剂盒中的集气窗是否有气泡产生，如未有产气则继续培养至48h±2h ;记录在24h和48h内产气的EC肉汤管数。如所有EC肉汤管均未产气，即可报告大肠埃希氏菌MPN结果；如有产气者，则进行EMB平板分离培养。
[0029]4.4鉴定:挑取EMB平板典型菌落做确正实验；
[0030]4.5结果:根据证实为大肠埃希氏菌阳性的试管管数，查MPN检索表，报告每g(mL)样品中大肠埃希氏菌MPN值；
[0031]5注意事项
[0032]5.1加入样品后不需摇匀，平拿平放；
[0033]5.2加样时可用一次性无菌塑料吸管，将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处；
[0034]5.3在培养箱中取试剂盒时应平托出来，不要倾斜以免液体外逸造成污染；
[0035]5.4试剂盒为一次性无菌包装用品，供一次性即开即用
[0036]6保存条件和有效期:
[0037]避光于保存于干燥处，最佳温度为2?8°C，有效期18个；[0038]备注:如果样品污染严重，实验时直接将1:10样品匀液加入试剂盒中，不需实验前加入无菌蒸馏水或无菌生理盐水即可，
[0039]备注:如果样品污染严重，每孔直接接种1:10样品的稀释液10mL，稀释后的10_2接种10mL，稀释后的10_3接种10mL，每个稀释度接种3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制备双料培养基及单料培养基试管的繁琐的工作。
[0040]阪岐肠杆菌的定量检测
[0041]试剂盒使用说明书
[0042]I适用范围:适用于食源性致病菌阪岐肠杆菌定量(MPN方法)的检测。
[0043]2方法原理:依据《2012年食源性致病菌监测工作手册》中的定量检验方法，采用包被技术将改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素培养基包被在试剂盒底部，随时取用，省去了实验前的大量准备工作，方便、快捷。
[0044]3试剂盒的组成:试剂盒由5个发酵增菌容器前后对应并排共10个发酵增菌容器组成，第1-9发酵增菌容器为试验盒，第10发酵增菌容器为试验对照盒。用前加入无菌蒸馏水或无菌生理盐水至盒的标线处即为IOmL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素
培养基。
[0045]4操作步骤
[0046]4.1样品制备:方法见《2012年食源性致病菌监测工作手册》中的阪岐肠杆菌定量检验(7.1)。
[0047]4.2增菌培养:
[0048]4.2.1试剂盒的准备:打开盒盖，试剂盒1-10发酵增菌容器中加入无菌盐水9~IOmL即可，备用。
[0049]4.2.2加样:用灭菌吸管分别吸取18小时培养后的三份不同重量前增菌,各ImL,(每份不同重量样品各取3个ImL)分别加入含有IOmL改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素的试剂盒的发酵增菌容器中(1-3，4-6，7-9。)。第10发酵增菌容器不加样液为阴性对照，置44°C ±0.5°C恒温箱内，培养24h ；
[0050]4.3分离培养:对所有显示浑浊并产生大量气体的试剂盒增菌液,用接种环接种于阪岐显色培养基平板上划线分离。置36°C培养24h±2h ；
[0051]4.4鉴定:挑取可疑菌落(蓝绿色)，划线接种胰蛋白胨大豆琼脂平板(TSA)，250C ±1°C培养24-48h，挑取黄色菌落用全自动微生物鉴定系统VITEK-2进行生化鉴定；
[0052]4.5结果:根据证实为阪岐肠杆菌的阳性管数查MPN检索表；
[0053]5注意事项
[0054]5.1加入样品后不需摇匀，平拿平放；
[0055]5.2加样时可用一次性无菌塑料吸管，将样品稀释液加至试剂盒所标刻度处；
[0056]5.3在培养箱中取试剂盒时应平托出来，不要倾斜以免液体外逸造成污染。
[0057]5.4试剂盒为一次性无菌包装用品，供一次性即开即用
[0058]6保存条件和有效期:
[0059]避光于保存于干燥处，最佳温度为2?8°C，有效期18个。
[0060]备注:如果样品污染严重，每孔直接接种1:10样品的稀释液10mL，稀释后的10_2接种10mL，稀释后的10_3接种10mL，每个稀释度接种3盒，(1-3，4-6，7-9。)省去了制备双料培养基及单料培养基试管的繁琐的工作。
[0061]食源性致病菌定量检测项目，包含了七种致病菌定量检测，相对有七种定量致病菌检测试剂盒。
[0062]以上所述，仅是本实用新型的较佳实施例而已，并非对本实用新型的结构作任何形式上的限制。凡是依据本实用新型的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本实用新型的技术方案的范围内。
【权利要求】
1.一种食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是:包括盒体、盒盖和若干个发酵增菌容器，所述盒体内均匀排列发酵增菌容器，所述发酵增菌容器内设有集气窗，所述集气窗前端与发酵增菌容器内前壁固接，集气窗末端与发酵增菌容器内底部固接，所述集气窗横向截面形状呈开口矩形，其纵向截面形状呈直角三角形，所述集气窗与发酵增菌容器固接后，在发酵增菌容器的底部呈坡度的气泡收集空间。
2.根据权利要求1所述的食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是:所述盒体、盒盖和发酵增菌容器均为无色透明体，采用能够降解的材料制成。
3.根据权利要求1或2所述的食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是:所述发酵增菌容器数量为十个，发酵增菌容器在盒体中前后排列各五个。
4.根据权利要求3所述的食源性致病菌定量检测试剂盒，其特征是:所述发酵增菌容器观测面的侧壁上设有试验标识刻线。
【文档编号】C12M1/34GK203668405SQ201320894143
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2013年12月30日 优先权日:2013年12月30日
【发明者】刘军 申请人:刘军