使用马铃薯糖蛋白的方法
【专利摘要】马铃薯糖蛋白，一种能够从马铃薯中获得的脂肪酶，被发现具有对于C4至C8脂肪酸的特异选择性，同样对存在于三酸甘油酯中的C4至C8脂肪酸也具有特异选择性。这使得马铃薯糖蛋白尤其适用于水解诸如存在于乳脂中的三酸甘油酯，以增强食品的风味。具体地，发现马铃薯糖蛋白有益于增强奶酪的风味。描述了一种应用脂肪酶的水解活性的方法以及马铃薯糖蛋白在制造奶酪的方法中的应用。
【专利说明】使用马铃薯糖蛋白的方法
【背景技术】
[0001] 在食品的生产中，脂质和其它酯类的分解对于风味、结构、纹理或纯度是重要的。 被称为水解的过程产生自由脂肪酸，其中，该自由脂肪酸是风味（即味觉和嗅觉的组合）的 重要因素。具体地，在乳脂中以相对大量存在的短链脂肪酸和中链脂肪酸是食物的风味的 强力因素。
[0002] 尽管利用强碱或酸能够化学地水解酯类，这些程序是粗糙且非特异性的，从而导 致产率的损失、不需要的副产物和浪费。酶水解通常更具有特异性，避免了这些问题的至少 一部分。脂肪酶是表面酶，其通常根据脂肪酸链长或脂肪酸链位置来选择用于具体脂质的 水解。该特异性决定了对于任何给定的应用，特异性脂肪酶的合适程度。
[0003] 脂肪酶的使用在工业中是常见的。实例包括外消旋药物拆分、脂肪和脂质改性、风 味合成以及药物制品和营养制品的生产。目前，尽管在一些应用中也使用动物源脂肪酶，但 是使用中的绝大多数的脂肪酶是利用真菌或细菌发酵体系来获得的。植物源脂肪酶对于工 业应用是相对稀少的。
[0004] 工业最适用的脂肪酶是通过细菌发酵而获得的，并且需要复杂的下游处理。这样 的脂肪酶倾向于在总基底和蛋白基底中具有低纯度，并且因此含有大量的糖类、盐并且可 能的不需要的副活性。此外，商购脂肪酶制剂通常含有多种非蛋白材料、盐和非脂肪酶的酶 (Bjurlin等人 2001JAOCS78-2p153-160)。
[0005] 脂肪酶用于在诸如奶酪的食品中产生风味是相当常见的，并且已经报告了多种不 同的脂肪酶。传统上，来自小牛或猪的消化酶（也被称为凝乳酶）将被加入到奶酪中，这是 由于凝乳酶能够引起奶的凝结，并且由于凝乳酶引起自由脂肪酸的产生，而自由脂肪酸赋 予奶酪以风味。该过程涉及需要死亡小牛或猪的昂贵的酶分离，这是繁琐的且不适用于素 食者。此外，其引入了疾病转移的可能性。
[0006] 通常，奶酪是通过奶的凝结来制得的，例如，通过加入凝乳酶和/或酸。经过凝结， 奶分离成凝乳和乳清。丢弃乳清，该乳清为奶蛋白的水溶液，同时收集凝乳并且轻轻挤压以 去除一些残余的水。尽管如此，所得到的凝乳含有大约30%的水，并且应当被认为是奶脂、 蛋白和水的胶体分散液。将合适的酶加入到奶或凝乳中（例如，以凝乳酶的形式）。对于大 多数的奶酪，凝乳随后进行熟化。
[0007] 在制造奶酪中，酶的作用是尤其通过酶解、蛋白水解和脂类分解来启动奶成分的 主降解途径。其涉及能够产生奶酪风味的一些化合物，诸如例如氨基酸，某些肽、酯、醛、酮、 酚和脂肪酸。在脂肪酸的组中，尤其是短链脂肪酸和中链脂肪酸用于纯粹风味的产生，而较 长链脂肪酸导致肥腻且不愉快的口感。不同的脂肪酸传递给奶酪不同类型的口感。例如， C4脂肪酸在牛奶的奶酪中存在量较高，而(：6脂肪酸在山羊奶酪中是常见的。然而，目前所 使用的脂肪酶对释放所需的风味成分以及避免不良的肥腻风味显示出较小选择性或没有 选择性。
[0008] 目前，微生物脂肪酶对于奶酪制造是优选的，并且通常，该应用是由转基因的细菌 来构成以得到一种特异性类型的脂肪酶。这种脂肪酶需要复杂且昂贵的分离方法，并且因 为反应通过需要持续太长的时间，可能导致最终产品的酸败。
[0009] 从马铃薯中能够得到植物源脂肪酶。马铃薯蛋白能够被分成三种类别：（i)马 铃薯糖蛋白家族，高度同源的酸性43kDa糖蛋白（高分子量部分"HMW"，含有高达40? 50wt. %的马铃薯蛋白）；（ii)基本5?25kDa蛋白酶抑制剂（"PI"，30-40wt. %的马铃薯 蛋白）以及（iii)其它蛋白，大多是高分子量蛋白（10?20wt. %的马铃薯蛋白）。已知的 是，马铃薯糖蛋白家族具有一些脂肪酶活性，并且能够经由一步色谱过程，随后通过浓缩和 干燥来得到。在申请W02008/069650中描述了尤其用于分离高纯度的马铃薯糖蛋白的高度 便捷的方法。
[0010] 在实际中，由于包括脂肪酶的马铃薯蛋白缺乏实际的商业用途，其主要用作动物 的原料。通常，即使马铃薯糖蛋白尤其对于磷脂质和单甘脂具有酯酶活性，但是由于马铃 薯糖蛋白对于三酸甘油酯是不活跃的，所以马铃薯糖蛋白的实际用途被认为是受限的（例 如参见Hirschberg等人，Eur.J.Biochem2001，268, 5037,Galliard等人·，Biochem. J. 1971，121，379 或Andrews等人，BiochemJ. 1988, 252, 199)。
【发明内容】
[0011] 本发明提供了一种在水相中利用马铃薯糖蛋白来水解特定类型的脂质的手段。已 经发现马铃薯糖蛋白能够从三酸甘油酯水解出C4至C8脂肪酸。然而，马铃薯糖蛋白将不会 或基本上不会水解链长度较长的甘油脂肪酸酯。因此，尤其是在水性环境中，马铃薯糖蛋白 对于短链脂肪酸和中链脂肪酸显示出了令人惊奇的选择性。已经发现，该选择性允许在制 造奶酪中的高的实际价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1 :测试小组的百分比，该测试小组用于记录在凝结前，奶中所示出的马铃薯糖 蛋白的浓度下，经马铃薯糖蛋白处理的奶酪与对照奶酪之间的差异。
[0013] 图2 :经由标记方法测定马铃薯糖蛋白在凝乳和乳清中的分布。A:凝结之前的奶。 B:凝结之后的奶。C:凝结之前，含2g/L未标记的马铃薯糖蛋白的奶。D:凝结之后，含2g/L 未标记的马铃薯糖蛋白的奶。E:凝结之前，含2g/L考马斯R-250-标记的马铃薯糖蛋白的 奶。F:凝结之后，含2g/L考马斯R-250-标记的马铃薯糖蛋白的奶。G:凝结之前，含2g/L 考马斯G250-标记的马铃薯糖蛋白的奶。H:凝结之后，含2g/L考马斯G-250-标记的马铃 薯糖蛋白的奶。
[0014] 图3 :在不同马铃薯糖蛋白剂量下，在凝乳酶-凝结后，乳清中回收的脂肪酶的活 性。
[0015] 图4 :在马铃薯糖蛋白剂量和感官特性之间的剂量-响应关系。
[0016] 图5 :马铃薯糖蛋白优先使奶酪脂肪朝向脂肪酸水解。
[0017] 图6 :在6周（6a)后和在13周（6b)后，在FFA源的挥发性奶酪风味化合物的增 加。
[0018] 图7 :两年间在HMW马铃薯蛋白粉末中的脂肪酶活性。
【具体实施方式】
[0019] 在本发明的范围中，马铃薯糖蛋白（patatin)应当被理解为表示天然马铃薯蛋白 分离物的高分子量（HMW)部分，具有30kDa或更高，尤其是35kDa或更高，并且更优选约 43kDa的分子量以及等电点小于5. 8,优选在4. 8和5. 5之间的糖蛋白的高度同源家族，其 构成约40?50wt. %的马铃薯蛋白。马铃薯糖蛋白是显示出酰基-水解酶反应性并且在马 铃薯块茎中占有高达总可溶蛋白的40wt%的糖蛋白的家族。在申请WO2008/069650中记 载了从马铃薯果实汁液（PFJ)或马铃薯汁（PFW)中分离马铃薯糖蛋白的详细说明，该申请 通过引用而并入本文。
[0020] WO2008/069650的方法需要在pH7?9下，通过二价金属阳离子处理马铃薯果实 汁液以使其絮凝，并且离心该絮凝的马铃薯果实汁液，从而形成上清液。随后，对上清液进 行利用能够结合马铃薯蛋白的吸附剂且在5?35°C的温度下以及低于11的pH下操作的膨 胀床吸附层析，从而将天然马铃薯蛋白吸附至吸附剂。最后，用洗脱剂，从吸附剂中洗脱出 至少一种天然马铃薯蛋白分离物。该方法尤其导致高纯度的分离的天然马铃薯糖蛋白，其 具有最小量的变性蛋白存在，并且具有稳定的溶解性的特征。
[0021] 马铃薯果实汁液在pH7?9,优选7. 0?7. 5下，用二价金属阳离子进行预处理以 絮凝不需要的材料，随后通过离心来分离絮凝物。尤其合适的二价金属阳离子为Ca2+。该 预处理从马铃薯果实汁液去除了不需要的材料，诸如带负电荷的聚合物、果胶、配糖生物碱 和微生物。具体地，果胶和配糖生物碱的去除是有利的，这是因为这些化合物粘附至马铃薯 蛋白并且可能引起絮凝，从而导致在溶解性和其它物理性质方面不稳定的蛋白分离物。
[0022] 在该方法的第二步骤中，对上清液进行膨胀床吸附层析。有利地，保持起始材料的 温度在35°C以下，以得到马铃薯糖蛋白的更好的稳定性。此外，优选地，使用适度的高流速， 通常在600?1200cm/h的范围内。膨胀床吸附层析在小于11的pH下，优选小于10的pH 下操作。
[0023] 在膨胀床吸附柱中，通过将预处理的马铃薯果实汁液中的天然马铃薯蛋白结合至 合适的吸附剂上而将其从上清液中分离出来。结合特定量的天然马铃薯蛋白的柱材料包括 混合式吸附材料，诸如AmershamStreamline?DirectCSTI(GE医疗），Fastline吸附材 料（Upfront色层分析A/S);大孔吸附材料，诸如安伯莱特（Amberlite) ?XAD7HP( &Haas公司）以及离子交换吸附剂。随后用合适的洗脱液洗脱带有吸附天然马铃薯蛋白的 吸附剂，从而得到天然马铃薯蛋白分离物，诸如马铃薯糖蛋白。优选地，洗脱剂具有在4至 12范围内，更优选在5. 5至11.0范围内的pH。
[0024] 在优选的实施方式中，利用混合式吸附材料，蛋白能够以等电点和分子量被分馏。 这就允许例如马铃薯糖蛋白部分和蛋白酶抑制剂部分的分离。在5. 7至8. 7的pH，优选5. 8 至6. 5的pH下洗脱马铃薯糖蛋白分离物。
[0025] 酰基-水解酶反应性通常被理解为（一类）酶通过水分子催化酯键水解以形成组 成的羧酸和醇的能力。通过适当地改变反应条件该反应有时是可逆的，在那种情况下，发生 羧酸和醇的酯化反应。可能影响反应方向的反应条件包括例如温度、反应物恒等式，和/或 存在的水、羧酸和醇的量。本发明公开了马铃薯糖蛋白具有高度选择酰基-水解酶反应性， 其使得马铃薯糖蛋白高度适用于奶酪制造。
[0026] 马铃薯糖蛋白的水解酶活性尤其涉及在脂质，尤其是单酰基甘油酯、双酰基甘油 酯和三酰基甘油酯中发现的酰基。已知的是，马铃薯糖蛋白的水解酶活性对于单酰基甘 油酯较强。然而，还报道了，发现对于三酸甘油酯没有这种活性（例如参见Hirschberg等 人，Eur.J.Biochem2001，268, 5037,Galliard等人·，Biochem.J. 1971，121，379 或Andrews 等人，BiochemJ. 1988, 252, 199)。根据本发明，惊奇地发现，尽管存在这些报道，但是事实 上，马铃薯糖蛋白存在三酸甘油酯水解酶活性，并且该活性对于C4至C8脂肪酸非常具有特 异性。
[0027] 脂肪酸是特征如下的一类化合物：在另一直链碳链上存在1-位的羧酸基团。碳链 的长度是脂肪酸的重要特性，从而具有10个连续直链碳原子的碳链的脂肪酸也被称为Cki 脂肪酸。通常，已知的脂肪酸为C4至C36脂肪酸。碳链可为饱和的，也可包括一个或多个双 键。
[0028] 传统上，利用不同的方法脂肪酸被分为几个组。一种方法是根据它们的饱和度来 对其进行分类。然后，一组的脂肪酸被定义为饱和脂肪酸，在它们的碳链中的任意两个碳原 子之间不具有双键。
[0029] 不饱和脂肪酸在碳链中具有一个或多个双键。在不饱和脂肪酸中，在碳链中存 在有一个双键的单不饱和脂肪酸（MUFA)以及在碳链中存在多个双键的多不饱和脂肪酸 (PUFA)。
[0030] 也可根据脂肪酸的碳链长度来对脂肪酸进行分类。因此，存在短链脂肪酸（SCFA)， 其具有小于6个碳原子的碳链。中链脂肪酸（MCFA)具有6至12个碳原子的碳链，以及长 链脂肪酸（LCFA)具有13至21个碳原子的碳链。非常长链脂肪酸（VLCFA)具有大于22个 碳原子的碳链。当根据链长分类脂肪酸时，碳链可为饱和的或单不饱和的或多不饱和的。
[0031] 脂肪酸存在于所有的生物体中，并且具有几种功能。通常，这些功能通过整合至大 分子一种或多种脂肪酸来表现。因此，脂肪酸可连接至糖、氨基酸或甘油衍生物，并且具有 从能量储存至细胞结构以及更多的功能。
[0032] 在本发明的范围中，脂质是任何这样的化合物：其中脂肪酸通过酯键联接至甘油 的羟基上。单酰基甘油酯（MG或单酸甘油酯）是甘油与一个脂肪酸的酯并且具有两个自 由羟基。双酰基甘油酯（DAG或双酸甘油酯）是甘油与两个脂肪酸的酯并且具有一个自由 羟基。三酰基甘油酯（TAG或三酸甘油酯）是甘油与三个脂肪酸的酯。通俗地，三酰基甘油 酯也被称为"脂肪"，油也被称为脂肪，但是"脂肪"通常用于表示固体或半固体的三酸甘油 酯，而"油"用于表示液体或粘性三酸甘油酯。
[0033] 存在有许多不同脂肪酸，并且各种脂肪酸的相对丰度在同一物种中接近恒定。各 种脂肪酸在三酸甘油酯中的分布几乎是随机的。因此，三酸甘油酯通常包括三种不同的脂 肪酸，但是发现具有两个相同脂肪酸的三酸甘油酯的统计学机会是不可忽视的。此外，自然 存在具有三个相同脂肪酸单元的三酸甘油酯。一个实例是三丁酸甘油酯（在单个甘油骨架 上有三个C4脂肪酸），已知其存在于黄油中。
[0034] 上述的所有的甘油和一种或多种脂肪酸的酯可被称为"脂质"。然而，脂质还包括 MG和DAG，其中MG-甘油或DAG-甘油的自由羟基被联接到另一基团，诸如磷酸酯基。两 个脂肪酸和磷酸基被联接到单个甘油分子的分子被称作磷脂质，而仅一个脂肪酸被联接到 甘油，剩余自由羟基的分子被称作溶血磷脂质。磷脂质或溶血磷脂质在磷酸酯基上可具有 其它取代基。例如，磷酸酯基被胆碱进一步官能化的磷脂质或溶血磷脂质被称为磷脂酰胆 碱，并且因此，其为一类磷脂，并且也是一类脂质。
[0035] 通俗地讲，术语脂质进一步包括这样的化合物：在该化合物中，一个或多个脂肪酸 通过酯键联接到糖，诸如单糖、二糖或多糖。在这种情况下，也被称为脂肪酸糖酯或糖脂。另 夕卜，脂质可包括脂肪酸的其它酯，诸如留醇酯。然而，在本发明的范围中，术语脂质被限制为 甘油的脂肪酸酯；这些脂肪酸与糖或留醇的其它酯并不认为是脂质的组中的一部分。
[0036] 脂质通常被分为两个组：极性脂质和中性脂质。极性脂质溶解在水中以形成例如 胶体或双分子层，而中性油脂显示出非常低的水溶解度。磷脂质被认为是极性脂质，并且通 常具有5和10之间的辛醇-水系数（LogP)。中性脂质具有低的水溶解度，并且通常具有 高于10的LogP。然而，确实存在具有较低辛醇-水系数的三酸甘油酯，诸如例如三乙酸甘 油酯（LogP= 0· 25)、三丁酸甘油酯（C4,LogP= 3. 27)、三己酸甘油酯（C6,LogP= 5. 6)、三 辛酸甘油酯（C8,LogP= 9. 2)，三癸酸甘油酯（Cltl)具有LogP= 10. 9。已经发现，马铃薯糖 蛋白在相对极性的三酸甘油酯（即，那些具有低于10的LogP)的水解中是有效的（参见下 文）。
[0037] 在本发明的范围中，术语三酸甘油酯包括单甘酯、双苷酯和三酸甘油酯。由于单苷 酯和双苷酯天然中基本上并不存在，而是通过三酸甘油酯的水解而形成，中性脂质的分解 总是开始于三酸甘油酯的分解。因此，在中性脂质水解的过程中，当发生三酸甘油酯水解时 是有利的。
[0038] 存在几种类型的混合物。在本发明的上下文中，重要的混合物类型是：
[0039] ?溶液
[0040] ?胶体分散液
[0041] ?乳液
[0042] ?悬浮液。
[0043] 丁铎尔效应是光通过大于所用光的波长的颗粒的弹性散射。如本领域所已知的， 其最常见于胶体分散液和悬浮液中，并且可被用于确定在这些介质中的粒径。
[0044] 在本文中所使用的体系可为任何液体环境或半液体环境,其将允许通过反应物的 分散来发生化学反应，从而它们能够"找到彼此"并且互相作用。其可采用均质溶液、悬浮 液、油包水乳液或水包油乳液，以及胶体分散液的形式，或液体形式或高度粘性透明固体的 形式。
[0045] 溶液是通过混合溶质和溶剂而形成的混合物。溶质为被溶解的物质。溶剂为进行 该溶解的物质。溶液是均质的并且并不显示出丁铎尔效应。
[0046] 胶体分散液是这样的混合物：在该混合物中，存在有两个或更多个不混溶的相，从 而一个相（被分布相或内部相）被分布在另一相（连续相）内。也可存在额外的不混溶 相。除了气体-气体分散体系并不存在之外，内部相可为液体、固体或气体，并且类似地，连 续相可为液体、固体或气体。胶体分散液似乎是均质的，但是实际上是异质的。然而，一种 或多种内部相被均质地分布在连续相中。在本发明的范围中的特征在于：当长时间静置时， 只要组成未发生化学改变，胶体分散液并不沉淀。凝乳和奶是胶体分散液的实例。胶体分 散液确实显示出了 丁铎尔效应。
[0047] 乳液是至少两种不混溶液体的异质混合物。由于液体分布相被分布在液体连续相 中，乳液也享有胶体分散液的该特征。然而，在本发明的范围中，当乳液被静置足够长的时 间时，乳液将沉淀出其构成相。因此，乳液与胶体分散液的区别在于：其在一定时间内保持 稳定体系，其中一个相被均质地分布在另一个相中。
[0048] 通常，将防止乳液分层的某一形式的稳定剂加入到乳液。然而，如果没有这种稳定 化作用，该体系将在一定时间内分成两层，至少直至发生分层时这样的体系被认为是乳液。 乳液显示出丁铎尔效应。
[0049] 悬浮液是固体和液体的异质混合物，其中，固体并未溶解。因此，它们包括至少两 相，其中，一个相均质地分布在另一个相中，并且享有胶体分散液的该特征。在本发明的术 语中，悬浮液具有大于固体-液体胶体分散液的颗粒，并且当静置时发生沉淀。悬浮液显示 丁铎尔效应。
[0050] 该发明公开了一种用于从三酸甘油酯水解脂肪酸的方法，该三酸甘油酯含有至少 一种C4至C8脂肪酸，该方法包括在水的存在下，对该三酸甘油酯遭遇马铃薯糖蛋白，其中， 该马铃薯糖蛋白水解C4至C8脂肪酸，或催化C4至C8脂肪酸的水解。
[0051] 在包括不同脂肪酸的三酸甘油酯混合物中，选择性地发生水解。这被解释为基本 上仅C4至C8脂肪酸从甘油骨架中水解出来。因此，马铃薯糖蛋白有助于C4至C8脂肪酸和 甘油骨架之间的酯键的分解。在马铃薯糖蛋白的存在下，具有更短或更长碳链的脂肪酸基 本上不水解，并且维持附接到甘油骨架。优选地，C4和C6脂肪酸被水解，并且尤其是在制造 牛奶奶酪，最优选的是仅水解C4脂肪酸；或尤其是在制造山羊奶酪中，仅水解C6脂肪酸。
[0052] 脂肪酸定位在甘油骨架上的位置并没有影响。外部脂肪酸位置（sn(l)和（sn(3)) 一定程度更有效地被水解，但是定位在中心位置（sn(2))的脂肪酸也可被水解。因此，在优 选的实施方式中，甘油骨架的外部位置优先在中心位置被水解。
[0053] 脂肪酸的饱和度并不相关，并且利用本发明能够水解饱和的C4至C8脂肪酸和不饱 和的C4至C8脂肪酸。然而，不饱和C4至C8脂肪酸是罕见的，从而优选地，根据本发明水解 饱和的C4至C8脂肪酸。
[0054] 因此，根据本发明，水解导致自由的C4至C8脂肪酸和双甘酯。随后，继续进行水解 以形成更多的自由脂肪酸和单甘酯和甘油。根据本发明，C4至C8脂肪酸的水解在水解完成 前的任何合适的时间处可被停止。
[0055] 在另一优选的实施方式中，三酸甘油酯的选择性水解仅限于在其甘油骨架上仅具 有C4至C8脂肪酸的那些三酸甘油酯。优选地，在这种情况下，在甘油骨架的外部位置处的 脂肪酸被选择性地水解。在进一步优选的实施方式中，用于水解的脂肪酸为C4脂肪酸和C6 脂肪酸，并且最优选，尤其是在制造牛奶奶酪中仅(；脂肪酸被水解；或尤其在制造山羊奶酪 中，仅C6脂肪酸被水解。
[0056] 根据本发明，待被水解的三酸甘油酯的水溶性最好用辛醇-水分配系数IogP来描 述。根据本发明的方法，待被水解的三酸甘油酯的LogP等于或低于10,优选地，低于9. 2， 优选地，低于6. 3。甚至更优选地，IogP应当在0.25至6. 3的范围内，并且甚至更优选地， 在3. 27至6. 3的范围内。在本发明的范围下，IogP被定义为在25°C下三酸甘油酯在辛醇 和去矿质水之间的分配系数，其可由本领域技术人员常规测定，例如利用烧瓶震荡法。
[0057] 天然脂肪或天然油主要由三酸甘油酯组成，该三酸甘油酯具有广泛的各种链长的 不同的脂肪酸。然而，天然脂肪或天然油可含有杂质，诸如双酸甘油酯，其通过三酸甘油酯 的水解而形成。天然脂肪和油中存在的各种脂肪酸可具有4至28个碳原子的碳链。根据 deJong和Badings, 1990,JHighResolutionChrom. 13:94-98,利用任何方法，诸如例如 通过GC-类方法可确定具体类型脂肪的脂肪酸谱图。优选地，该方法涉及天然脂肪或天然 油的水解。
[0058] 本发明所使用的马铃葉糖蛋白源自于马铃葉前科前属（Solanumtuberosum)。优 选地，在淀粉研磨后得到的马铃薯汁液中分离出马铃薯糖蛋白。马铃薯汁液来自于用于工 业淀粉生产或直接人类消耗或饲料的所有类型的马铃薯品种。优选地，马铃薯糖蛋白从马 铃薯汁液中分离出来，并且优选地，其也被纯化，诸如来自于其它马铃薯蛋白和杂质。此外， 对根据本发明的方法优选的是利用天然形式的马铃薯糖蛋白，即，未变性的马铃薯糖蛋白。 最优选地，使用在水相中自由溶解或分散的天然马铃薯糖蛋白。
[0059] 在任何溶剂或没有溶剂下，只要存在足够的水以允许进行水解，即可完成根据本 发明的酯的水解。本发明的重要方面是，尽管多数的脂肪酶在亲水区和疏水区之间的界面 上起作用，但是马铃薯糖蛋白最好在水相中起作用。因此，本发明的方法适用于在水的存在 下，优选在水相中，用马铃薯糖蛋白使三酸甘油酯水解。优选地，这种水相被包括在更疏水 的相中，诸如乳液或胶体分散液中，以允许疏水相中非极性三酸甘油酯和水相中马铃薯糖 蛋白之间的充分接触。此外，水相可为多相体系中的连续相。至今为止，已经证实了的马铃 薯糖蛋白的实际应用包括水溶液、悬浮液或乳液，其中，是否是油包水乳液或水包油乳液并 不是重要的。然而，最优选地，马铃薯糖蛋白被用在胶体分散液或乳液中从三酸甘油酯中水 解一种或多种脂肪酸的方法中。在使用乳液的情况下，优选为油包水乳液。
[0060] 在本发明中，首要条件是存在足够的水以允许在任何体系中使C4至C8脂肪酸水解 离开三酸甘油脂的甘油骨架。就该点而言，足够的水意味着：以总体系的百分比来计，水含 量至少为1体积％，优选为至少5体积％，更优选至少10体积％，更优选至少15体积％，更 优选至少20体积％，并且最优选至少25体积％。
[0061] 优选地，适用于水解一种或多种C4至C8脂肪酸的温度为在该温度下，马铃薯糖蛋 白是活化的，诸如，4°C至80°C，优选为KTC至65°C。对于慢反应速率产生最好结果的过程， 诸如，奶酪制造来说，最好使用11°C至23°C，优选13°C的温度。对于需要较高反应速率的过 程，最好使用刚刚低于变性条件的温度，例如诸如50°C至65°C。
[0062] 类似地，应当使用在该pH下马铃薯糖蛋白是活化的pH，进行C4至C8脂肪酸的水解 的合适的pH值为在4. 5和9之间，优选为8. 5。对于奶酪的制造，使用的最佳的pH在4. 8 和6. 7之间。
[0063] 在本发明的一个更优选的实施方式中，发生C4至C8脂肪酸水解的乳液或胶体分散 液包括乳脂。乳脂天然地富含短链三酸甘油酯和中链三酸甘油酯，为此原因，马铃薯糖蛋白 高度适用于奶的选择性水解。因此，乳液或胶体分散液优选地包括奶。
[0064] 含有包括(；至(：8脂肪酸的三酸甘油酯的任何类型的奶能够被马铃薯糖蛋白水解。 因此，任何哺乳动物的奶是合适的，包括奶牛、绵羊、山羊、驴、马、水牛、牦牛、驯鹿、骆驼和 驼鹿。然而，优选地，奶牛、绵羊或山羊的奶，尤其是奶牛的奶与马铃薯糖蛋白组合使用。 [0065] 在替代优选的实施方式中，本发明的乳液或胶体分散液是凝乳。凝乳是由奶得到 的胶体分散液，包括三酸甘油酯、马铃薯糖蛋白和约30%的水。三酸甘油酯包括相对高丰度 的C4至C8脂肪酸，这使得它们高度适用于通过马铃薯糖蛋白来选择性水解。凝乳采用各种 类固体块的形式。此外，其用于制造奶酪。
[0066] 通过将马铃薯糖蛋白加入到在食品生产过程中使用的乳液或胶体分散液中（诸 如优选奶或凝乳）以水解C4至C8脂肪酸，与使用其它脂肪酶相比，短链脂肪酸风味成分和 中链脂肪酸风味成分以较高的速率从甘油骨架中释放出来。就该点而言，风味是味觉和嗅 觉的组合。其允许了使用马铃薯糖蛋白以增强食品的风味。根据该实施方式，水解在这样 的体系中进行：该体系为食品的起始材料或起始材料的一部分。优选地，该食品为奶酪，更 优选地，为意大利式奶酪、蓝奶酪或酶改性奶酪。在该优选的实施方式中，例如，水解在用于 制造奶酪的奶中进行，并且因此形成制备该食品，即奶酪的方法的一部分。
[0067] 与使用其它脂肪酶（诸如微生物脂肪酶或凝乳酶）相比，在奶酪制造过程中使用 马铃薯糖蛋白具有相当的优势。对于C4至C8脂肪酸的特异性导致加速的奶酪生产过程，和 /或导致具有增强风味的奶酪。为此，加入马铃薯糖蛋白的凝乳或奶能够便利地用于奶酪制 造中。
[0068] 当马铃薯糖蛋白被用在制造奶酪的方法中时，其可被加入在制造奶酪的任何相或 所有相中。其可被直接加入到凝乳中，但是优选地，马铃薯糖蛋白被加入到凝结之前的奶 中。在凝结过程中，其将主要分出凝乳。所得到的凝乳含有约30%的水，并且应当被认为是 乳脂、马铃薯糖蛋白和水的胶体分散液。与利用其他源的酶相比，利用马铃薯糖蛋白的优点 在于，马铃薯糖蛋白具有从乳脂三酸甘油酯中释放C4至C8脂肪酸的高选择性，增加了奶酪 熟化的速度，并且增加风味的发展，从而增强了风味。同时，防止了赋予奶酪肥腻口感的较 长链长的脂肪酸的水解，因为马铃薯糖蛋白对此类底物没有反应性。此外，马铃薯糖蛋白选 择性地水解释放风味的脂肪酸而不水解甘油的其它脂肪酸酯，从而防止由于过度大量水解 而引起酸败的失控反应。最后，与许多微生物脂酶相比，马铃薯糖蛋白很容易去活化。
[0069] 将温度升高至普通巴氏灭菌法温度，诸如例如，在50°C和80°C之间，优选70°C至 75°C并且更优选75°C，基本不减除马铃薯糖蛋白的活性。在75°C，在至多IOs内观察到活 性降低90%，而在70°C，在17s内观察到活性降低90%。观察到了pH依赖性，导致在较低 pH下具有较长的去活化时间，然而，在pH6. 7时，马铃薯糖蛋白的活性在75°C下，在8. 2s 内降低至90%。
[0070] 马铃薯糖蛋白可与其它酶，诸如例如天然凝乳酶或微生物凝乳酶组合使用，从而 增加奶酪的熟化速度以及赋予增加的风味发展。马铃薯糖蛋白可与任何类型的奶凝结物组 合物使用。因此，通过加入马铃薯糖蛋白，有益于通过凝乳酶或通过微生物凝结的酶促凝乳 的奶酪。此外，由于马铃薯糖蛋白特异性水解性质，所以加入的马铃薯糖蛋白有益于酸凝乳 的奶酪以及乳清奶酪。
[0071] 因此，本发明公开了一种生产奶酪的方法，包括使用马铃薯糖蛋白。该方法包括以 下步骤：
[0072] ?使奶凝结以得到凝乳；
[0073] ?浙干（drain)凝乳；以及
[0074] ?形成新鲜奶酪，可选地，随后进行熟化步骤；
[0075] 其中，如上所述，将马铃薯糖蛋白加入到奶或加入到凝乳中以水解一种C4至C 8脂 肪酸。
[0076] 如本领域所已知的，通过加入酸和/或凝乳酶能够完成奶的凝结。优选地，上述奶 为奶酪奶，其为用于具体类型的奶酪已经标准化和/或经过巴氏消毒的奶。如上所述，可使 用任何的奶。
[0077] 凝结引起凝乳的形成。同时，形成可溶的奶蛋白的水溶液，也被称为乳清。优选地， 将发酵剂加入到奶或加入到凝乳中。如本领域所知的，发酵剂包括至少一种酶，优选为酶混 合物，其降解奶成分，诸如脂肪和蛋白以凝固奶酪，并且以引起风味形成。如在本方法中，将 马铃薯糖蛋白加入到奶、凝乳或发酵剂中，增强了风味的形成，并且因此在制造奶酪中是高 度有益的。
[0078] 浙干凝乳意味着从凝乳中分离出乳清的至少一部分。通常，通过挤压来完成，但是 也可以想到其它方法。优选地，凝乳是成型的和/或经腌制的，以得到诱人的形状和口味， 并且用于防止微生物的生长。
[0079] 充分浙干的结果是新鲜奶酪的形成。某些奶酪是通常以新鲜奶酪而食用，但是，通 常，熟化步骤提高奶酪的品质。因此，可选地，允许对新鲜奶酪进行熟化。熟化新鲜奶酪意 味着将浙干的凝乳静止一定时间，该时间取决于奶酪的类型。熟化的软奶酪通常具有最小 的熟化时间，但是其它类型的奶酪可需要长很多的时间，诸如几个月或几年来熟化。足够时 间的熟化导致最终奶酪。
[0080] 优选地，奶酪诸如意大利式奶酪，蓝奶酪和/或酶改性奶酪能够根据该方法来制 备，并且因此，优选使用马铃薯糖蛋白来增加意大利式奶酪，蓝奶酪和/或酶改性奶酪的风 味。
[0081] 现将通过下列非限制性实施例来说明本发明。
[0082]实施例1:在酸-凝结的全奶中马铃薯糖蛋白催化的脂类分解的可行性
[0083] 在实验室热板上加热在2L的烧杯中的IL的全奶。经过煮沸，关闭加热元件，并且 在搅拌下，加入乙酸使得从30%溶液直至形成凝乳。在滤锅中利用奶酪布收集凝乳，并且使 该凝乳进行冷却。将凝乳分成两个部分。将IOmL的10%w:V的马铃薯糖蛋白溶液（Solanic 206P)缓慢倾倒在一个部分中，同时将IOmL的去矿质水倾倒在另一个部分中用作未处理的 对照。通过轻轻挤压从凝乳中去除残余乳清。在5分钟内，马铃薯糖蛋白处理的凝乳块散 发出强烈的奶酪气味，而未处理的对照保持煮沸的奶气味。
[0084] 实施例2 :凝乳酶-凝结的奶酪中的马铃薯糖蛋白剂量-响应关系
[0085] 凝乳酶购自西格玛-奥德里奇（R5876)。全奶的500mL等分被补充有浓度在 0.lmg/L和I.Og/L之间的马铃薯糖蛋白，并且通过10mg/L凝乳酶的作用在35°C下凝结90 分钟。除了不加入马铃薯糖蛋白之外，相似地制备对照的凝结奶（"HMW")。通过奶酪布和 挤压来滤出凝结物从而回收凝乳部分。将所得到的材料完全浸没在90g/L氯化钠溶液中1 小时来进行腌制，并且随后使该材料在室温下进行熟化三天。要求由生化实验室人员组成 的9人测试小组以确定表明是否每种奶酪的气味都显著不同于不含有马铃薯糖蛋白的对 照奶酪的气味。三天之后，含lmg/L或更多马铃薯糖蛋白的奶酪具有与对照奶酪显著不同 的气味（对于图表结果，参见图1)。
[0086] 实施例3 :在凝乳酶-引起的凝结中的凝乳和乳清中马铃薯糖蛋白的分布
[0087] 马铃薯糖蛋白标记
[0088]SolanicHMW马铃薯蛋白分离物被用作基本纯的马铃薯糖蛋白制剂。考马斯亮蓝 来自于默克（G-2501. 15444,R-2501. 12553)。HHO凝胶过滤柱来自于GE医疗。凝乳酶购 自西格玛-奥德里奇（R5876)。
[0089] 在去矿物质水中制备马铃薯糖蛋白的4.0% (m:m)溶液，并且在室温下，在恒定搅 拌下用等摩尔量的考马斯亮蓝R-250或考马斯亮蓝G-250温育30分钟。在温育后，在roiO一次性凝胶过滤柱上通过凝胶过滤从蛋白上去除任何未结合的染料。将染料标记的马铃薯 糖蛋白溶液储存在-28°C下直至使用。
[0090] 经由标记的马铃薯糖蛋白来确定马铃薯糖蛋白在凝乳和乳清上的分布
[0091] 奶的5mL等分被补充有20mg/L至2. Og/L之间的不同剂量的经标记的马铃薯糖蛋 白。如果需要，通过加入去矿物质水来保持总体积的恒定。所得到的混合物以及作为对照 的未处理的牛奶通过加入l〇mg/L的凝乳酶，在35°C下温育90分钟而凝结。所得到的材料 通过在9000g下离心10分钟而被分成凝乳和乳清。该乳清随后被转移至微量试管中并且 在15000g下再次离心10分钟以得到略微不透明的溶液。
[0092] 拍摄凝乳部分和乳清部分的照片以允许光学地检查染料的分布（图2)。由于通过 离心或微量过滤不足以除去残余的浑浊性，乳清中蓝染料的量的分光定量分析未成功。[0093] 经由脂肪酶活性测量来确定马铃薯糖蛋白在凝乳和乳清上的分布
[0094] 已知的脂肪酶物质购自西格玛-奥德里奇（4-硝基苯基辛酸酯，21742)。奶的5mL 等分被补充有50mg/L至500mg/L之间的不同剂量的马铃薯糖蛋白。如果需要，通过加入 去矿物质水来保持总体积的恒定。所得到的混合物以及作为对照的未处理的奶通过加入 10mg/L的凝乳酶，在35°C下温育90分钟而凝结。所得到的材料通过在9000g下离心10分 钟而被分成凝乳和乳清。该乳清随后被转移至微量试管中并且在15000g下再次离心10分 钟以得到略微不透明的溶液。将其在去矿质水中稀释10000倍。将凝乳部分在pH7. 5的 IOOmM的柠檬酸盐缓冲液中再悬浮，并且也进行稀释。将原始奶溶液的等分部分也稀释至相 同的程度。在96孔板中将100μL的这些稀释液暴露在pH8. 0的含2mM的4-硝基苯基辛 酸酯的100μL的30mMTris-HCl溶液中，并且利用BioRad型608酶标仪在室温下以10秒 间隔在405nm处分析吸光度5分钟（图3)。乳清中马铃薯糖蛋白的活性远远低于加入的马 铃薯糖蛋白的活性，这表明了在奶凝结过程中，马铃薯糖蛋白主要分配在凝乳中。
[0095] 实施例4 :马铃薯糖蛋白失活
[0096] 由于在乳清中残余的脂肪酶可导致剩余乳脂的降解，所以乳清中剩余的脂肪酶可 能是不需要的。这将导致在乳清中存在挥发性的难闻的自由脂肪酸，随着时间变化会改变 口味。此外，由乳清制备的产品将含有脂解活性，潜在地限制了它们的应用。
[0097] 将马铃薯糖蛋白（Solanic206PHMW马铃薯蛋白）以lg/L的浓度溶解在pH5、6 和7的缓冲溶液中以及溶解在pH6. 7的新鲜制备的乳清中。经由在截流系统中热辐射量 测量残余活性来构建在这些溶液中的脂肪酶活性的动力学降解模型。
[0098] 通过将全奶在30°C下暴露在10mg/L的凝乳酶（西格玛-奥德里奇，R5876)下90 分钟来制备乳清，并且经由奶酪布通过过滤来去除凝乳。马铃薯糖蛋白溶液被暴露在50°C 和80°C的温度下，暴露时间在4ms直至IOs的范围内。通过在340nm下测量在pH8.0的 30mM的磷酸盐缓冲液下在4-甲基-乙酰氧基香豆素（AlfaAesarA12147)上作用3分钟 的马铃薯糖蛋白溶液的吸光度的增加来测量脂肪酶活性。通过Anton和Barret的方法基 本上根据阿累尼乌斯动力学来拟合该数据（Anton，G.E.和BarrotD.M.，2002JAFC，50，p.4 119-25"InactivationofQuality-RelatedEnzymesinCarrotsandPotatoes，'）。
[0099] 表I:在不同条件下的马铃薯糖蛋白的热失活。D-值代表引起活性降低90%所需 的时间，并且以秒来记录。k为以赫兹计的反应速率，Ea为以kj/mol计的失活反应的活化 能量。
[0100]
【权利要求】
1. 一种用于从三酸甘油酯水解脂肪酸的方法，所述三酸甘油酯含有至少一种(；至(:8脂 肪酸，所述方法包括：在水的存在下，使所述三酸甘油酯遭遇马铃薯糖蛋白，其中，所述马铃 薯糖蛋白水解(；至(:8脂肪酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，所述水解发生在乳液或胶体分散液中。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述马铃薯糖蛋白处于天然形式。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，所述乳液或胶体分散液包括乳脂。
5. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述乳液或胶体分散液包括奶。
6. 根据权利要求4所述的方法，其中，所述乳液或胶体分散液是凝乳。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，所述凝乳被用在奶酪制造中。
8. 根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，所述马铃薯糖蛋白随后通过加热到 50 °C和80 °C之间的温度而失活。
9. 根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述三酸甘油酯具有等于或低于 9. 2,或优选低于6. 3的水-辛醇分配系数。
10. 根据权利要求5或6所述的方法，其中，所述水解导致食品的风味增强。
11. 根据权利要求10所述的方法，其中，所述食品为奶酪。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中，所述奶酪为意大利式奶酪、蓝奶酪或酶改性奶 酪。
13. -种制造奶酪的方法，所述方法包括以下步骤： 使奶凝结以得到凝乳； 浙干所述凝乳；以及 形成新鲜奶酪，可选地，随后进行熟化步骤， 其中，根据权利要求1至12中任一项所述的将马铃薯糖蛋白加入到所述奶中或被加入 到所述凝乳中以水解C4至C8脂肪酸。
【文档编号】A23C19/05GK104428419SQ201380035673
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年7月3日 优先权日:2012年7月4日
【发明者】罗宾·埃里克·雅各布斯·斯贝尔布灵克, 马尔克·路易吉·费代里科·朱塞平, 马敦·罗伯特·艾格蒙特 申请人:艾维贝合作公司