包含具有大范围核酸酶活性的序列的组合物和方法

包含具有大范围核酸酶活性的序列的组合物和方法
【专利摘要】本发明提供了包含具有大范围核酸酶活性的多核苷酸和多肽的组合物和方法。另外提供了具有大范围核酸酶序列的核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。提供了使用所述大范围核酸酶序列的各种方法。此类方法包括用于制备在宽泛的温度范围具有提高的活性的大范围核酸酶的方法、用于制备包含具有提高的活性的大范围核酸酶的酵母、植物、植物细胞、外植体或种子的方法。
【专利说明】包含具有大范围核酸酶活性的序列的组合物和方法
[0001] 本申请要求提交于2012年5月4日的美国临时申请61/642470和提交于2012年 8月16日的美国临时申请61/683765的权益；两者的全文以引用方式并入本文。

【技术领域】
[0002] 本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明涉及具有大范围核酸酶活性的序 列。

【背景技术】
[0003] 通过重组DNA技术，很容易将外源DNA序列插入生物体的基因组，从而改变所述生 物体的表型。最常用的植物转化方法是农杆菌感染法和基因枪粒子轰击法，其中转基因以 随机模式和不可预知的拷贝数整合至植物基因组中。因此，研究人员正在努力控制植物中 的转基因整合。
[0004] 已经使用了位点特异性整合技术（采用了位置特异性整合系统以及其它类型的 整合系统）以在多个生物体中生成目的基因的靶向插入。
[0005] 其它插入和修饰DNA序列的方法涉及通过导入两翼为与基因组靶标同源的序列 的转基因 DNA序列的同源DNA重组。美国专利5, 527, 695描述了用DNA序列（靶向真核生 物DNA的预先确定的序列）转化真核细胞。通过使用选择性标记（作为被导入的DNA序列 中的一部分）鉴定经转化的细胞。
[0006] 虽然两种系统已经提供了对于目的序列的靶向插入可用的技术，但仍然存在对便 于精确改造植物或酵母基因组的核酸酶的需求。此外，存在对于具有增大的、能在很宽的温 度范围内引入双链断裂的大范围核酸酶的需求。


【发明内容】

[0007] 提供了包含具有大范围核酸酶活性的多核苷酸和多肽的组合物和方法。还提供了 包含编码变体大范围核酸酶的多核苷酸的组合物，所述变体大范围核酸酶包含至少一个氨 基酸修饰，其中所述变体大范围核酸酶提高了活性。另外提供了具有大范围核酸酶序列的 核酸构建体、酵母、植物、植物细胞、外植体、种子和谷物。
[0008] 提供了使用所述大范围核酸酶序列的各种方法。此类方法包括用于提高细胞、酵 母、植物细胞、植物外植体或种子中的大范围核酸酶活性。还提供了允许各种大范围核酸酶 多核苷酸和变体及其片段在很宽的温度范围内在酵母或植物细胞中表达的方法和组合物。 此类方法和组合物应用于制备具有改善的大范围核酸酶活性的酵母、植物细胞、植物和外 植体。
[0009] 因此在第一实施例中，本发明涉及分离的或重组的多核苷酸，其包含编码大范围 核酸酶多肽的核苷酸序列，所述多肽包含：a)在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置 处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :1的位置选自位置2、12、16、 22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、 117、118、121、124、128、129、131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、 188、189、190、191、192、194、195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、 258、267、278、281、282、289、308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、 以及它们的组合；或b)具有（a)的任何氨基酸修饰中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43或44个的氨基酸序列。
[0010] 在其它实施例中，本发明涉及本公开的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷 酸序列编码大范围核酸酶多肽，其与SEQ ID N0:1具有至少80%、81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的 序列同一性。
[0011] 在另一个实施例中，本发明涉及实施例1的分离的或重组的多核苷酸和其对应的 多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰包括：a)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位 置处的天冬氨酸（D) ;b)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I) ;d)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C) ;e)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置 23的位置处的亮氨酸（L) ;f)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸 (R) ;g)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N) ;h)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L) ;i)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置 50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K) ;j)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置56的位 置处的亮氨酸（L) ;k)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); 1)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A) ;m)在对 应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V) ;n)在对应于SEQ ID NO :1中 氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K) ;〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置72的位置 处的苏氨酸（T) ;p)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A) ;q)在 对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R) ;r)在对应于SEQ ID NO :1 中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K) ;s)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置82的位 置处的精氨酸（R) ;t)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); u)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I) ;v)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I) ;w)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置 98的位置处的精氨酸（R) ;x)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸 (V) ;y)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸（S) ;z)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸⑵；aa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位 置116的位置处的精氨酸（R) ;bb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置117的位置处的 甘氨酸（G) ;cc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴；dd)在 对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G) ;ee)在对应于SEQ ID NO : 1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R) ;ff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128 的位置处的半胱氨酸（C) ;gg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨 酸（A) ;hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R) ;ii)在对应 于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸⑶；jj)在对应于SEQ ID NO :1中 氨基酸位置151的位置处的丙氨酸⑷；kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的 位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M) ;11)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位 置处的色氨酸（W) ;mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V) ;〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸⑴；pp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置 163的位置处的精氨酸（R) ;qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨 酸⑶；rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L) ;ss)在对应于 SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R) ;tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基 酸位置167的位置处的组氨酸（H) ;uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处 的脯氨酸（P) ;w)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A) ;ww)在 对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸⑵；XX)在对应于SEQ ID NO : 1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H) ;yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172 的位置处的脯氨酸（P) ;zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸 (R) ;aaa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L) ;bbb)在对应于 SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸（P) ;ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨 基酸位置176的位置处的谷氨酸（Q) ;ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位 置处的丙氨酸（A) ;eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V) ;ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酸（Q) ;hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸 位置182的位置处的缬氨酸（V) ;iii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置183的位置处 的脯氨酸（P) ;jjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K) ;kkk) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶；111)在对 应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S) ;mmm)在对应于SEQ ID NO :1 中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E) ;nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188 的位置处的亮氨酸（L) ;〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸 (E) ;ppp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酸（Q) ;qqq)在对应于 SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L) ;rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨 基酸位置194的位置处的脯氨酸⑵；sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位 置处的赖氨酸（K) ;ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F) ;vvv)在对应于 SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I) 在对应于SEQ ID NO :1中 氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V) ;xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的 位置处的亮氨酸（L) ;yyy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸 (C) ;ZZZ)在对应于SEQ ID NO: 1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L) ;aaaa)在对应 于SEQ ID NO :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I) ;bbbb)在对应于SEQ ID NO :1 中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S) ;cccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置237 的R位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R) ;dddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置246的 位置处的组氨酸（H) ;eeee)在对应于SEQ ID NO: 1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨 酸（I) ;ffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S) ;gggg)在对 应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R) ;hhhh)在对应于SEQ ID NO : 1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置 281的位置处的酪氨酸（Y) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置282的位置处的苯 丙氨酸（F) ;kkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T) ;1111) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G) ;_m)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R) ;nnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位 置312的位置处的丙氨酸（A) ;〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置316的位置处的 丙氨酸（A) ;pppp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R) ;qqqq) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A) ;rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F) ;SSSS)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸 位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L) ;tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位 置342的位置处的丝氨酸（S) ;uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的 天冬酰胺（N) ;vvvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N); wwww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或xxxx)a)至 wwww)的任何组合。
[0012] 在另一个实施例中，本发明涉及实施例1的分离的或重组的多核苷酸和其对应的 多肽，其中所述核苷酸序列编码大范围核酸酶多肽，其中所述多肽还包含至少一种本文所 述的氨基酸修饰，诸如表5A-5C、表9A-9D、表10A-10C、表11、表12、表13、表14A-B和表15 中所示的那些以及任何已知的I-Crel型修饰、以及它们的任何组合。
[0013] 在另一个实施例中，本发明涉及分离的或重组的多核苷酸和其对应的多肽，其中 所述核苷酸序列编码大范围核酸酶多肽，其选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、93、94、 95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、 115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、 134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、 153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、272、 273、274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、 296、297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、360、 361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、397、 398、399、400、401、402、403、430、431、432 和 433。
[0014] 在另一个实施例中，本发明涉及本公开的分离的或重组的多核苷酸和其对应的多 肽，其中所述核苷酸序列编码大范围核酸酶多肽，其中所述多肽能够识别并切开大范围核 酸酶识别序列，所述大范围核酸酶识别序列选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :85、SEQ ID NO: 269、SEQ ID N0:281、SEQ ID N0:331、SEQ ID N0:358、SEQ ID N0:390、SEQ ID N0:423 或 SEQ ID NO :424。
[0015] 在另一个实施例中，本发明涉及本公开的分离的或重组的多核苷酸和其对应的多 肽，其中所述核苷酸序列编码大范围核酸酶多肽，其中所述多肽在与缺乏所述氨基酸修饰 的对照大范围核酸酶进行比较时具有提高的大范围核酸酶活性。所述对照大范围核酸酶可 选自 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :250、SEQ ID NO :270、SEQ ID NO :271、SEQ ID NO:282、SEQ ID NO:283、SEQ ID NO:329、SEQ ID NO:356、SEQ ID NO:389、SEQ ID NO: 429或SEQ ID NO :435或任何I-CreI型大范围核酸酶。提高的大范围核酸酶的活性可以 通过任何测量大范围核酸酶活性的方法来证实，包括但不限于a)在与缺乏所述氨基酸修 饰的对照大范围核酸酶进行比较时酵母测定分数更高；或b)在与缺乏所述氨基酸修饰的 对照大范围核酸酶进行比较时目标位点突变率更高；或c)在与缺乏所述氨基酸修饰的对 照大范围核酸酶进行比较时体外切割更高；或d)那些方法的任何组合。此外，可在宽泛的 温度范围测量提高的活性，诸如温度包括16°C、24°C、28°C、30°C或37°C以及在16°C至37°C 之间的温度。
[0016] 在另一个实施例中，本发明涉及分离的或重组的多核苷酸，其还包括编码N-末端 核转运肽的核苷酸序列和/或编码C-末端组氨酸标签的核苷酸序列。
[0017] 在另一个实施例中，本发明涉及重组DNA构建体，其包含本公开的分离的或重组 的多核苷酸。所述重组DNA构建体可还包含可操作地连接至所述多核苷酸的启动子。所述 启动子相对于所述重组的多核苷酸可以为异源的。
[0018] 在另一个实施例中，本发明涉及包含本公开的重组构建体的细胞、植物细胞、酵母 细胞、植物、酵母或种子。所述植物细胞可以为单子叶植物或双子叶植物细胞。所述单子叶 植物细胞可来自玉米、小麦、稻、大麦、甜菜、高粱或裸麦。所述双子叶植物细胞可来自大豆、 芸苔属植物（Brassica)、向日葵、棉花或苜猜。
[0019] 在另一个实施例中，本发明涉及包含本公开的重组构建体的植物以及得自此类植 物的种子或植物提取物、外植体。
[0020] 在另一个实施例中，本发明涉及制备大范围核酸酶的方法，所述大范围核酸酶在 一定温度范围具有提高的活性，所述方法包括：
[0021] a)通过在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处修饰至少一个氨基酸来 制备大范围核酸酶变体，所述SEQ ID N0:1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、 50、56、58、59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、 128、129、131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、 172、173、174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、194、195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、 282、289、308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；以 及
[0022] b)选择来自步骤a)的所述大范围核酸酶变体，并且筛选能够在16°C至37°C之间 并包括16°C和37°C的温度范围内裂解DNA目标序列的所述大范围核酸酶变体。
[0023] 在另一个实施例中，本发明涉及制备大范围核酸酶的方法，所述大范围核酸酶在 与对照大范围核酸酶进行比较时具有提高的大范围核酸酶活性，所述方法包括：
[0024] a)通过在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处修饰至少一个氨基酸来 制备大范围核酸酶变体，所述SEQ ID N0:1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、 50、56、58、59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、 128、129、131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、 172、173、174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、 192、194、195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、 282、289、308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；以 及
[0025] b)选择来自步骤a)的所述大范围核酸酶变体，并且筛选在与对照大范围核酸酶 进行比较时具有提高的大范围核酸酶活性的所述变体。
[0026] 在另一个实施例中，本发明涉及在酵母或植物细胞的基因组中导入双链断裂的方 法，所述方法包括：
[0027] a)使至少一种在其基因组中包含大范围核酸酶识别位点的植物或酵母细胞与大 范围核酸酶多肽变体接触，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、 272、273、274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、 295、296、297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、 360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、 397、398、399、400、401、402和403,其中所述大范围核酸酶变体能够在所述识别位点诱导 双链断裂；以及
[0028] b)选择来自a)的酵母或植物细胞，并且针对所述识别序列的任何修饰筛选所述 酵母或植物细胞。
[0029] 在另一个实施例中，本发明涉及将目的多核苷酸整合至植物或酵母细胞的基因组 中的识别位点的方法，所述方法包括：
[0030] a)使至少一种在其基因组中包含大范围核酸酶识别位点的植物或酵母细胞与下 列物质接触：
[0031] (i)大范围核酸酶多肽变体，其选自 SEQ ID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、 116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、 135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、 154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、272、273、 274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、 297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、360、361、 362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、397、398、 399、400、401、402 和 403，
[0032] 其中所述大范围核酸酶变体能够在所述识别位点诱导双链断裂；和
[0033] (ii)包含目的多核苷酸的DNA片段；
[0034] b)选择至少一种植物或酵母细胞，其包含在所述识别位点整合的目的多核苷酸 盒。
[0035] 在另一个实施例中，本发明涉及分离的或重组的多核苷酸以及其对应的多肽，其 编码大范围核酸酶多肽，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有 至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID N0:1的位置选自位置16、22、50、56、59、 71、81、103、121、153、185、209、222、246、258、281、308、316、345、346、以及它们的组合，并且 其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :2的大范围核酸酶目标位点。
[0036] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :86的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修 饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :86的位置选自位置2、12、16、22、23、36、43、50、56、58、 59、72、73、81、86、91、95、103、113、114、120、121、124、128、129、131、151、153、200、204、209、 232、236、237、246、254、258、267、281、308、311、312、316、319、334、339、340、342、以及它们 的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :85的大范围核酸酶目标位点。
[0037] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :270的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修 饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :270的位置选自位置16、22、50、71、185、246、258、316、以 及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :269的大范围核酸酶目 标位点。
[0038] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :329的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸 修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :329的位置选自位置12、32、50、56、80、105、124、129、 131、153、185、311、316、318、340、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含 SEQ ID NO :328的大范围核酸酶目标位点。
[0039] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :356的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修 饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :356的位置选自位置12、24、36、50、56、62、73、80、124、 129、147、182、203、237、252、311、316、318、340、348、以及它们的组合，并且其中所述多肽能 够识别和裂解包含SEQ ID NO :355的大范围核酸酶目标位点。
[0040] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :389的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修 饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :389的位置选自位置12、50、56、124、129、131、153、211、 237、311、316、和位置318、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQID NO :388的大范围核酸酶目标位点。
[0041] 在另一个实施例中，本发明涉及编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷 酸，所述多肽包含在对应于SEQ ID NO :429的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修 饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :429的位置选自位置16、22、50、71、185、246、258、316、以 及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :423的大范围核酸酶目 标位点。

【专利附图】

【附图说明】 [0042] 和序列表
[0043] 根据以下的详细描述和附图以及序列清单，可以更全面地理解本发明，以下的 详细描述和附图以及序列清单形成本申请的一部分。序列描述以及所附序列表遵循37 C.F.R. § § 1.8211. 825示出的专利申请中核苷酸和氨基酸序列公开的规定。序列描述包含 如37 C.F.R. § § 1.8211. 825中规定的针对每种氨基酸的三字母代码，其以引用方式并入 本文。
[0044] 图1提供了 I-CreI大范围核酸酶（SEQ ID NO :3)与来自各个物种的相关的大范 围核酸酶（SEQ ID NO :4-13)的氨基酸比对。加框显示了共享同一性的氨基酸残基。
[0045] 图2显示了表示用于测定酵母中大范围核酸酶活性的酵母筛选系统的图表。对应 于酵母Ade2编码序列的最初1000个核苷酸（Ade25'片段）和酵母Ade2编码序列的最后 1011个核苷酸（Ade23'片段）的基因片段被包括酵母ura3基因（Ura3)和针对I-SceI的 大范围核酸酶识别位点的片段分开。
[0046] 图3显示了用于定量大范围核酸酶活性的酵母菌落的数值刻度与相应的白色分 段。由于分段表型是大范围核酸酶活性的定性测量，采用了 0-4的数字打分系统。0分表明 没有观察到白色分段（没有大范围核酸酶切割）；4分表明完全白色菌落（识别位点的完全 切割）；1_3分表明中间白色分段表型（和中间程度的识别位点切割）。
[0047] 图4显示了大范围核酸酶表达质粒pVER8134。
[0048] 图5提供了亲本LIG3-4(LIG3-4.pro，SEQ ID N0:1)和LIG3-4大范围核酸酶变体 (表1A，SEQ ID NO :14-38)的氨基酸比对。在图5中列出的大范围核酸酶的名称对应于表 IA中的名称，但包括".pro "表明这是一个蛋白比对。
[0049] 图6A-C显示了在0、25、50和75分钟，由实时聚合酶链反应（PCR)的三次重复平均 的、亲本 LIG3-4 和 LIG3-4 大范围核酸酶变体（B65 = LIG3-4(B65) ;hitl5 = LIG3-4(15); hit7 = LIG3-4(7))裂解质粒DNA底物的百分比。在23°C观察到仏）％的裂解。在28°〇观 察到⑶％的裂解。在37°C观察到（C) %的裂解。
[0050] 图7显示了在50分钟，由实时聚合酶链反应（PCR)的三次重复平均的、亲本 LIG3-4 和 LIG3-4 大范围核酸酶变体（B65 = LIG3-4(B65) ;hitl5 = LIG3-4(15) ;hit7 = LIG3-4(7))裂解基因组DNA底物的百分比。在23°C观察到（A)%的裂解。在28°C观察到 (B) %的裂解。在37°C观察到（C) %的裂解。
[0051] 图8A显示了用于确认UBI :m〇PAT :PinII盒整合至内源性LIG3-4识别位点的长片 段聚合酶链反应（PCR)的方框图。图8B显示了在所述识别位点发生整合的情况下，在来自 四个事件的愈伤组织上长片段聚合酶链反应（PCR)的结果。图8B-左显示了在HRl侧使用 基因组引物（HRRl)和moPAT引物（mopatR2)的长连接片段聚合酶链反应（PCR);图8B-右 显示了在HR2侧（mopatF2/HR2R2)的长连接片段聚合酶链反应（PCR)。引物组mopatF2/ HR2R2扩增了 4kb片段，其跨越从moPAT基因穿过UBI内含子、UBI启动子和HR2序列至相 邻基因组区。引物组HRRl/mopatR2扩增了 2. 2kb的片段，其跨越从moPAT基因穿过HRl至 相邻基因组区。这两个长聚合酶链反应（PCR)产物的大小表明所述供体基因盒完美整合至 LIG3-4识别位点。在来自愈伤组织事件之一 TO和Tl植物中获得了插入序列。
[0052] 图9A-9D提供了亲本MHP77和MHP77大范围核酸酶变体的氨基酸比对。显示了在 与亲本大范围核酸酶MHP77进行比较时，所述大范围核酸酶变体的氨基酸修饰。A(-)指出 变体和亲本大范围核酸酶的氨基酸残基相同。
[0053] 图10A-10C提供了亲本MHP14和MHP14大范围核酸酶变体的氨基酸比对。显示了 在与亲本大范围核酸酶MHP14进行比较时，所述大范围核酸酶变体的氨基酸修饰。A(-)指 出变体和亲本大范围核酸酶的氨基酸残基相同。
[0054] 图11提供了亲本MHP107和MHP107大范围核酸酶变体的氨基酸比对。显示了在 与亲本大范围核酸酶进行比较时，所述大范围核酸酶变体的氨基酸修饰。A(-)指出变体和 亲本大范围核酸酶的氨基酸残基相同。
[0055] 图12提供了亲本ZM6. 3和ZM6. 3大范围核酸酶变体的氨基酸比对。显示了在与 亲本大范围核酸酶进行比较时，所述大范围核酸酶变体的氨基酸修饰。A(-)指出变体和亲 本大范围核酸酶的氨基酸残基相同。
[0056] 图13提供了亲本ZM6. 22v2和ZM6. 22v2大范围核酸酶变体的氨基酸比对。显示 了在与亲本大范围核酸酶进行比较时，所述大范围核酸酶变体的氨基酸修饰。A(-)指出变 体和亲本大范围核酸酶的氨基酸残基相同。
[0057] 图14提供了 LIG3-4和多个大范围核酸酶的氨基酸比对。显示了和SEQ ID NO : 1不同的氨基酸修饰。A(-)指出大范围核酸酶的氨基酸残基与LIG3-4大范围核酸酶（SEQ ID NO :1)相同。
[0058] 图15 A)显示了一些大范围核酸酶（其包含接头多肽将两个的重新工程化 的I-CreI单体连成单个氨基链）的氨基酸比对。B)显示了一些变体（MHPH(IO)、 MHP77(L9-01)和亲本（LIG3-4、MHP14、MHP77)大范围核酸酶的百分比同一性。
[0059] 图16显示了所述大范围核酸酶的结构因子。
[0060] 序歹1丨
[0061] SEQ ID NO :1是单链LIG3-4大范围核酸酶融合多肽的氨基酸序列。
[0062] SEQ ID NO :2是LIG3-4识别序列的核苷酸序列。
[0063] SEQ ID NO :3是I-CreI大范围核酸酶单体的氨基酸序列。
[0064] SEQ ID NO :4 是 gi_18654305 的氨基酸序列。
[0065] SEQ ID NO :5 是 gi_108773071 的氨基酸序列。
[0066] SEQ ID NO :6 是 gi_108773352 的氨基酸序列。
[0067] SEQ ID NO :7 是 gi_108796958 的氨基酸序列。
[0068] SEQ ID NO :8 是 gi_12667512 的氨基酸序列。
[0069] SEQ ID NO :9 是 gi_18654311 的氨基酸序列。
[0070] SEQ ID NO :10 是 gi_150406493 的氨基酸序列。
[0071] SEQ ID NO :11 是 gi_110225678 的氨基酸序列。
[0072] SEQ ID NO : 12 是 gi_l 1467050 的氨基酸序列。
[0073] SEQ ID NO :13 是 gi_18654162 的氨基酸序列。
[0074] SEQ ID NO : 14是LIG3-4大范围核酸酶的氨基酸序列。
[0075] 表IA :亲本和大范闱核酸酶夺体的SEQ ID NO : (NT =核苷酸序列：AA =氨某酸序 列）列表。
[0076]
[0077]

【权利要求】
1. 一种分离的或重组的多核苷酸，其包含编码大范围核酸酶多肽的核苷酸序列，所述 多肽包含： a) 在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸 序列，所述 SEQ ID NO :1 的位置选自位置 2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、 72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、 151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、 197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、 312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；或 b) 具有（a)的任何氨基酸修饰中的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43或44个的氨基酸序列。
2. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与SEQ ID NO :1具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
3. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰包 括： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); X)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); y) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸（S); z) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); aa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); bb) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); cc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； dd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); ee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); ff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C): gg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸⑶； jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); 11)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); w) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸（P); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); hhh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); iii) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); jjj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); ккк) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶； 111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); yyy)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); zzz)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); аааа) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); bbbb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); cccc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); dddd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); eeee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); ffff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); gggg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); hhhh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); iiii)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); jjjj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); kkkk)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); 1111)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); _m)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); nnnn)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); vwv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N); 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 xxxx)a)至wwww)的任何组合。
4.根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽还包含： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置19的位置处的丝氨酸⑶或丙氨酸（A); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置24的位置处的甲硫氨酸（M); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置28的位置处的精氨酸（R)或丙氨酸（A); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置30的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、谷氨 酰胺（Q)、半胱氨酸（C)、甘氨酸（G)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、亮氨酸（L)、谷氨酸（E)或脯 氨酸（P); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置32的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、赖氨 酸⑷、谷氨酰胺（Q)、甘氨酸（G)或亮氨酸（L); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置54的位置处的异亮氨酸⑴或亮氨酸（L); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置57的位置处的谷氨酸（E); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); x) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置79的位置处的甘氨酸（G); y) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); z) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); aa)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); bb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); cc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置87的位置处的亮氨酸（L); dd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); ee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); ff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); gg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置105的位置处的丙氨酸（A); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置111的位置处的精氨酸（R); jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸⑶； kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); II) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置132的位置处的缬氨酸（V); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸（S); vv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); iii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); jjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); kkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸⑵； III) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶： xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); yyy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); zzz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); aaaa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); bbbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); cccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); dddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置192的位置处的氨基酸缺失； eeee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); ffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); gggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); hhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); iiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); jjjj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); kkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); 1111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置206的位置处的丙氨酸（A)或丝氨酸（S); _m)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); nnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置211的位置处的甲硫氨酸（M); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置241的位置处的异亮氨酸（I)或亮氨酸 (L)； tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置244的位置处的谷氨酸（E); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); vvvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置253的位置处的天冬氨酸（D)或组氨酸 (H)； 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); xxxx)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); yyyy)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); zzzz)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); aaaaa) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); bbbbb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); ccccc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); ddddd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置292的位置处的丙氨酸（A); eeeee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); fffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); ggggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); hhhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); iiiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); jjjjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置319的位置处的缬氨酸（V); kkkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); 11111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); mmmmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); nnnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); 〇〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); ppppp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N);或 qqqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 rrrrr)a)至qqqqq)的任何组合。
5. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、272、273、274、 275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、 298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、360、361、362、 363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、397、398、399、 400、401、402、403、430、431、432 和 433。
6. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽能够识别和裂解大范围核酸酶识别序列，所述大范围核酸酶识 别序列选自 SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:85、SEQ ID N0:269、SEQ ID N0:281、SEQ ID N0:331、 SEQ ID NO :358、SEQ ID NO :390、SEQ ID NO :423 或 SEQ ID NO :424。
7. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范围 核酸酶多肽，其中所述多肽在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时具有 提1?的大范围核酸酶活性。
8. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述对照大范围核酸酶选自 SEQ ID N0：USEQ ID NO ： 86, SEQ ID NO ： 250, SEQ ID NO ： 270, SEQ ID NO ： 27 U SEQ ID NO： 282、SEQIDN0:283、SEQIDN0:329、SEQIDN0:356、SEQIDN0 :389、SEQIDN0:429 * SEQ ID NO :435。
9. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述提高的大范围核酸酶活 性的证据是： a)在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的酵母测定得分； 或 b) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的目标位点突变率； 或 c) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的体外切割；或 d) (a)、（b)和（c)的任何组合。
10. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其还包含编码N-末端核转运肽 的核苷酸序列。
11. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其还包含编码C-末端组氨酸标 签的核苷酸序列。
12. 根据权利要求7所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述提高的大范围核酸酶 活性是在16°C、24°C、28°C、30°C或37°C下测定的。
13. -种重组DNA构建体，其包含权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸。
14. 根据权利要求13所述的重组DNA构建体，其还包含可操作地连接至所述多核苷酸 的启动子。
15. 根据权利要求14所述的重组DNA构建体，其中所述启动子相对于所述多核苷酸是 异源的，或所述启动子相对于所述多核苷酸是同源的。
16. -种细胞，其包含至少一种权利要求1所述的多核苷酸或权利要求13所述的重组 DNA构建体，其中所述多核苷酸对于所述细胞是异源的。
17. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是酵母细胞。
18. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是植物细胞。
19. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述重组DNA构建体稳定地掺 入至所述植物细胞的基因组中。
20. 根据权利要求16所述的细胞，其中所述多核苷酸或所述重组DNA构建体稳定地掺 入至所述植物细胞的叶绿体基因组中。
21. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
22. 根据权利要求21所述的细胞，其中所述单子叶植物为玉米、小麦、稻、大麦、甘蔗、 高粱或黑麦。
23. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
24. 根据权利要求23所述的细胞，其中所述双子叶植物为大豆、芸苔属植物 (Brassica)、向日葵、棉花或苜猜。
25. -种植物，其包含权利要求18所述的植物细胞。
26. -种植物外植体，其包含权利要求18所述的植物细胞。
27. 根据权利要求26所述的植物、外植体或植物细胞，其中所述植物、外植体或植物细 胞在与不包含至少一种权利要求1所述的多核苷酸的相同物种、品系或品种的植物、外植 体或植物细胞进行比较时表现出提高的大范围核酸酶活性。
28. -种转基因种子，其由权利要求25所述的植物产生。
29. -种具有大范围核酸酶活性的分离的多肽，所述多肽包含： a)在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸 序列，所述 SEQ ID NO :1 的位置选自位置 2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、59、62、71、 72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、131、147、 151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、 176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、195、196、 197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、308、311、 312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；或 b)具有（a)的任何氨基酸修饰中的至少 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43或44个的氨基酸序列。
30. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO :1具有至少80% 的序列同一'I"生。
31. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述至少一个氨基酸修饰包括： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); x) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); y) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸（S); z) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); aa)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); bb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); cc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； dd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); ee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); ff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C); gg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); hh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); ii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸⑶； jj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); kk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); II) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); mm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); nn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); 〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); vv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸（P); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); aaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); iii) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); jjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); kkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶； III) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); yyy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); zzz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); aaaa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); bbbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); cccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); dddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); eeee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); ffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); gggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); hhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); iiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); jjjj)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); kkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); 1111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); _m)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); nnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); vwv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N); 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 xxxx)a)至wwww)的任何组合。
32.根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述多肽还包含： a) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置2的位置处的天冬氨酸（D); b) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置12的位置处的组氨酸⑶； c) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置16的位置处的异亮氨酸（I); d) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置19的位置处的丝氨酸⑶或丙氨酸（A); e) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置22的位置处的半胱氨酸（C); f) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置23的位置处的亮氨酸（L); g) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置24的位置处的甲硫氨酸（M); h) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置28的位置处的精氨酸（R)或丙氨酸（A); i) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置30的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、谷氨 酰胺（Q)、半胱氨酸（C)、甘氨酸（G)、丝氨酸（S)、苏氨酸（T)、亮氨酸（L)、谷氨酸（E)或脯 氨酸（P); j) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置31的位置处的精氨酸（R); k) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置32的位置处的精氨酸（R)、丙氨酸（A)、赖氨 酸⑷、谷氨酰胺（Q)、甘氨酸（G)或亮氨酸（L); l) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置36的位置处的天冬酰胺（N); m) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置43的位置处的亮氨酸（L); n) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置50的位置处的精氨酸（R)或赖氨酸（K); 〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置54的位置处的异亮氨酸⑴或亮氨酸（L); P)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置56的位置处的亮氨酸（L); q) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置57的位置处的谷氨酸（E); r) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置58的位置处的异亮氨酸（I); s) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置59的位置处的组氨酸⑶或丙氨酸（A); t) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置62的位置处的缬氨酸（V); u) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置71的位置处的赖氨酸（K); v) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置72的位置处的苏氨酸（T); w) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置73的位置处的丙氨酸（A); x) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置79的位置处的甘氨酸（G); y) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置80的位置处的精氨酸（R); z) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置81的位置处的赖氨酸（K); aa)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置82的位置处的精氨酸（R); bb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置86的位置处的天冬氨酸（D); cc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置87的位置处的亮氨酸（L); dd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置91的位置处的异亮氨酸（I); ee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置95的位置处的异亮氨酸（I); ff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置98的位置处的精氨酸（R); gg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置103的位置处的缬氨酸（V); hh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置105的位置处的丙氨酸（A); ii)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置111的位置处的精氨酸（R); jj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置113的位置处的丝氨酸⑶； kk)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置114的位置处的脯氨酸（P); 11)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置116的位置处的精氨酸（R); mm)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置117的位置处的甘氨酸（G); nn)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置118的位置处的苏氨酸⑴； 00)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置121的位置处的甘氨酸（G); PP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置124的位置处的精氨酸（R); qq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置128的位置处的半胱氨酸（C); rr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置129的位置处的丙氨酸（A); ss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置131的位置处的精氨酸（R); tt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置132的位置处的缬氨酸（V); uu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置147的位置处的丝氨酸（S); vv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置151的位置处的丙氨酸（A); ww)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置153的位置处的亮氨酸（L)或甲硫氨酸（M); xx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置159的位置处的色氨酸（W); yy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置160的位置处的谷氨酸（E); zz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置161的位置处的缬氨酸（V); aaa)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置162的位置处的酪氨酸（Y); bbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置163的位置处的精氨酸（R); ccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置164的位置处的组氨酸（H); ddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置165的位置处的亮氨酸（L); eee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置166的位置处的精氨酸（R); fff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置167的位置处的组氨酸（H); ggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置168的位置处的脯氨酸（P); hhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置169的位置处的丙氨酸（A); iii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置170的位置处的脯氨酸（P); jjj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置171的位置处的组氨酸（H); kkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置172的位置处的脯氨酸⑵； 111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置173的位置处的精氨酸（R); mmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置174的位置处的亮氨酸（L); nnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置175的位置处的脯氨酸⑵； 〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置176的位置处的谷氨酰胺（Q); PPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置177的位置处的丙氨酸（A); qqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置178的位置处的精氨酸（R); rrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置179的位置处的缬氨酸（V); sss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置180的位置处的谷氨酰胺（Q); ttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置182的位置处的缬氨酸（V); uuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置183的位置处的脯氨酸（P); vvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置184的位置处的赖氨酸（K); www)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置185的位置处的苏氨酸⑴或组氨酸⑶； xxx)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置186的位置处的丝氨酸（S); yyy)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置187的位置处的谷氨酸（E); zzz)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置188的位置处的亮氨酸（L); aaaa) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置189的位置处的谷氨酸（E); bbbb)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置190的位置处的谷氨酰胺（Q); cccc)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置191的位置处的亮氨酸（L); dddd)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置192的位置处的氨基酸缺失； eeee)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置194的位置处的脯氨酸（P); ffff)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置195的位置处的赖氨酸（K); gggg)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置196的位置处的丝氨酸（S); hhhh)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置197的位置处的苯丙氨酸（F); iiii)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置200的位置处的异亮氨酸（I); jjjj) 在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置203的位置处的缬氨酸（V); kkkk)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置204的位置处的亮氨酸（L); 1111)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置206的位置处的丙氨酸（A)或丝氨酸（S); _m)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置209的位置处的半胱氨酸（C); nnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置222的位置处的亮氨酸（L); 〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置211的位置处的甲硫氨酸（M); PPPP)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置232的位置处的异亮氨酸（I); qqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置236的位置处的丝氨酸（S); rrrr)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置237的位置处的亮氨酸（L)或精氨酸（R); ssss)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置241的位置处的异亮氨酸（I)或亮氨酸 (L)； tttt)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置244的位置处的谷氨酸（E); uuuu)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置246的位置处的组氨酸（H); vvvv)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置253的位置处的天冬氨酸（D)或组氨酸 (H)； 醫醫）在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置254的位置处的异亮氨酸（I); xxxx)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置258的位置处的丝氨酸（S); yyyy)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置267的位置处的精氨酸（R); zzzz)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置278的位置处的异亮氨酸（I); aaaaa) 在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置281的位置处的酪氨酸（Y); bbbbb)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置282的位置处的苯丙氨酸（F); ccccc)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置289的位置处的苏氨酸（T); ddddd)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置292的位置处的丙氨酸（A); eeeee)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置308的位置处的甘氨酸（G); fffff)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置311的位置处的精氨酸（R); ggggg)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置312的位置处的丙氨酸（A); hhhhh)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置316的位置处的丙氨酸（A); iiiii)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置318的位置处的精氨酸（R); jjjjj)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置319的位置处的缬氨酸（V); kkkkk)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置334的位置处的丙氨酸（A); 11111)在对应于SEQ ID N0 :1中氨基酸位置339的位置处的苯丙氨酸（F); mmmmm)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置340的位置处的甘氨酸（G)或亮氨酸（L); nnnnn)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置342的位置处的丝氨酸（S); 〇〇〇〇〇)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置345的位置处的天冬酰胺（N); ppppp)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置346的位置处的天冬酰胺（N);或 qqqqq)在对应于SEQ ID NO :1中氨基酸位置348的位置处的天冬酰胺（N);或 rrrrr)a)至qqqqq)的任何组合。
33. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、 272、273、274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、 295、296、297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、 360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、 397、398、399、400、401、402、430、431、432 和 433。
34. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述多肽能够识别和裂解大范围核酸酶 识别位点，所述大范围核酸酶识别位点选自SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:85、SEQ ID N0:269、 SEQIDN0:281、SEQIDN0:331、SEQIDN0:358、SEQIDN0 :390、SEQIDN0:423 *SEQ ID NO :424。
35. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述多肽在与缺乏所述氨基酸修饰的对 照大范围核酸酶进行比较时具有提高的大范围核酸酶活性。
36. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述对照大范围核酸酶选自SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO :86、SEQ ID NO :250、SEQ ID NO :270、SEQ ID NO :271、SEQ ID NO :282、SEQ ID NO :283、SEQ ID NO :329、SEQ ID NO :356、SEQ ID NO :389、SEQ ID NO :429 或 SEQ ID NO :435。
37. 根据权利要求29所述的分离的多肽，其中所述提高的大范围核酸酶活性的证据 是： a) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的酵母测定得分； 或 b) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的目标位点突变率； 或 c) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的体外切割；或 d) (a)、（b)和（c)的任何组合。
38. -种组合物，其包含权利要求29所述的至少一种或多种多肽。
39. -种制备大范围核酸酶的方法，所述大范围核酸酶在一定温度范围内具有提高的 活性，所述方法包括： a)通过在对应于SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处修饰至少一个氨基酸来制备大 范围核酸酶变体，所述SEQ ID NO :1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、 59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、 131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、 195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、 308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；以及 b)选择来自步骤a)的所述大范围核酸酶变体，并且筛选能够在16°C至37°C之间且包 括16°C和37°C的温度范围内裂解DNA目标序列的所述大范围核酸酶变体。
40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述温度范围包括： a) 16°C ； b) 18°C ； c) 20°C ； d) 24〇C ； e) 28〇C ； f) 30°C ； g) 37。。；或 h) a)、b)、c)、d)、e)、f)、h)、g)和 g)的任何组合。
41. 一种制备大范围核酸酶的方法，所述大范围核酸酶在与对照大范围核酸酶进行比 较时具有提高的大范围核酸酶活性，所述方法包括： a) 通过在对应于SEQ ID NO: 1的位置的氨基酸位置处修饰至少一个氨基酸来制备大 范围核酸酶变体，所述SEQ ID NO :1的位置选自位置2、12、16、22、23、31、36、43、50、56、58、 59、62、71、72、73、80、81、82、86、91、95、98、103、113、114、116、117、118、121、124、128、129、 131、147、151、153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、 174、175、176、177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、194、 195、196、197、200、203、204、209、222、232、236、237、246、254、258、267、278、281、282、289、 308、311、312、316、318、319、334、339、340、342、345、346、348、以及它们的组合；以及 b) 选择来自步骤a)的所述大范围核酸酶变体，并且筛选在与对照大范围核酸酶进行 比较时具有提高的大范围核酸酶活性的所述变体。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中所述提高的大范围核酸酶活性的证据是： a) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的酵母测定得分； 或 b) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的目标位点突变率； 或 c) 在与缺乏所述氨基酸修饰的对照大范围核酸酶进行比较时更高的体外切割；或 d) (a)、（b)和（c)的任何组合。
43. 根据权利要求1所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述大范围核酸酶多肽包 含接头多肽，其中所述接头多肽包括： a) SEQ ID NO ：420 ； b) SEQ ID NO :421 ; c) SEQ ID NO :422 ;或 d)由在对应于SEQ ID NO :1的位置156至193的位置处的任何可能的氨基酸组成的 氨基酸序列。
44. 一种组合物，其包含权利要求1所述的至少一种或多种多核苷酸。
45. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :1的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :1 的位置选自位置 16、22、50、56、59、71、81、103、121、153、185、209、222、246、258、281、 308、316、345、346、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :2 的大范围核酸酶目标位点。
46. 根据权利要求45所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :1具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
47. 根据权利要求45所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图5A-5C中所示氨基酸修饰中的任何一个。
48. 根据权利要求45所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID NO :14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37 和 38。
49. 一种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :86的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :86 的位置选自位置 2、12、16、22、23、36、43、50、56、58、59、72、73、81、86、91、95、103、 113、114、120、121、124、128、129、131、151、153、200、204、209、232、236、237、246、254、258、 267、281、308、311、312、316、319、334、339、340、342、以及它们的组合，并且其中所述多肽能 够识别和裂解包含SEQ ID NO :85的大范围核酸酶目标位点。
50. 根据权利要求49所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :86具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
51. 根据权利要求49所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图9A-9D中所示氨基酸修饰中的任何一个。
52. 根据权利要求49所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID NO :87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、 155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252 和 253。
53. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :270的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :270的位置选自位置16、22、50、71、185、246、258、316、以及它们的组合，并且其中所 述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :269的大范围核酸酶目标位点。
54. 根据权利要求53所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:272、273、274和275。
55. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :282的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :282 的位置选自位置 12、16、22、31、50、56、59、62、81、98、103、105、116、118、121、 153、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、 177、178、179、180、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、258、281、308、312、 316、319、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID N0:281的大范 围核酸酶目标位点。
56. 根据权利要求55所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :282具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
57. 根据权利要求55所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图10A-10C中所示氨基酸修饰中的任何一个。
58. 根据权利要求55所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:284、285、286、287、288、289、290、 291、292、293、294、295、296、297 和 298。
59. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :329的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :329 的位置选自位置 12、32、50、56、80、105、124、129、131、153、185、311、316、318、 340、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :328的大范围核 酸酶目标位点。
60. 根据权利要求59所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :329具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
61. 根据权利要求59所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图11中所示氨基酸修饰中的任何一个。
62. 根据权利要求59所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:330、331、332、333、334、335、336、 337、338、339、340 和 341。
63. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :356的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :356 的位置选自位置 12、24、36、50、56、62、73、80、124、129、147、182、203、237、252、 311、316、318、340、348、以及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :355的大范围核酸酶目标位点。
64. 根据权利要求63所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :356具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
65. 根据权利要求63所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图12中所示氨基酸修饰中的任何一个。
66. 根据权利要求63所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:357、358、359、360、361、362、363、 364、365、366、367、368、369、370 和 371。
67. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :389的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :389 的位置选自位置 12、50、56、124、129、131、153、211、237、311、316、和位置318、以 及它们的组合，并且其中所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :388的大范围核酸酶目 标位点。
68. 根据权利要求67所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码与 SEQ ID NO :389具有至少80%的序列同一性的大范围核酸酶多肽。
69. 根据权利要求67所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述至少一个氨基酸修饰 包括在图13中所示氨基酸修饰中的任何一个。
70. 根据权利要求67所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:390、391、392、393、394、395、396、 397、398、399、400、401、402 和 403。
72. -种酵母、植物、植物细胞、外植体或种子，其包含通过权利要求36-42所述的方法 创建的大范围核酸酶。
73. -种在酵母或植物细胞的基因组中导入双链断裂的方法，所述方法包括： a) 使至少一种在其基因组中包含大范围核酸酶识别位点的植物或酵母细胞与大范围 核酸酶多肽变体接触，所述大范围核酸酶多肽变体选自SEQ ID N0:14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、90、91、92、 93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、 114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、 133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、 152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、251、252、253、 272、273、274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、 295、296、297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、357、358、359、 360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、394、395、396、 397、398、399、400、401、402和403,其中所述大范围核酸酶变体能够在所述识别位点诱导 双链断裂；以及 b) 选择来自a)的酵母或植物细胞，并且针对所述识别序列的任何修饰筛选所述酵母 或植物细胞。
74. -种将目的多核苷酸整合至植物或酵母细胞的基因组中的识别位点的方法，所述 方法包括： a)使至少一种在其基因组中包含大范围核酸酶识别位点的植物或酵母细胞与下列物 质接触： (i)大范围核酸酶多肽变体，所述大范围核酸酶多肽变体选自SEQ ID N0:14、15、16、 17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、87、88、89、 90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、 111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、 130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、 149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、 251、252、253、272、273、274、275、272、273、274、275、284、285、286、287、288、289、290、291、 292、293、294、295、296、297、298、330、331、332、333、334、335、336、337、338、339、340、341、 357、358、359、360、361、362、363、364、365、366、367、368、369、370、371、390、391、392、393、 394、395、396、397、398、399、400、401、402 和 403， 其中所述大范围核酸酶变体能够在所述识别位点诱导双链断裂；和 (ii)包含目的多核苷酸的DNA片段； b)选择至少一种植物或酵母细胞，所述植物或酵母细胞包含在所述识别位点整合的目 的多核苷酸盒。
75. -种编码大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，所述多肽包含在对应于 SEQ ID NO :429的位置的氨基酸位置处具有至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，所述SEQ ID NO :429的位置选自位置16、22、50、71、185、246、258、316、以及它们的组合，并且其中所 述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :423的大范围核酸酶目标位点。
76. 根据权利要求75所述的分离的或重组的多核苷酸，其中所述核苷酸序列编码大范 围核酸酶多肽，所述大范围核酸酶多肽选自SEQ ID N0:430、431和432。
77. -种编码SEQ ID NO :436的大范围核酸酶多肽的分离的或重组的多核苷酸，其中 所述多肽能够识别和裂解包含SEQ ID NO :424的大范围核酸酶目标位点。
【文档编号】C12N15/82GK104411823SQ201380035464
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2013年5月1日 优先权日:2012年5月4日
【发明者】E.伯穆德兹, A.M.西甘, J.恩格里斯, S.C.发科, H.高, L.刘, Z-B.刘, A.安格, S.斯维塔舍夫, J.K.杨 申请人:纳幕尔杜邦公司, 先锋国际良种公司