一种木瓜蛋白酶制剂及固定化方法
【专利摘要】本发明公开了一种木瓜蛋白酶制剂及固定化方法，包括如下步骤：（1）将纤维素纳米晶基材分散在pH为5-9的缓冲溶液中，配置成基材溶液；（2）将（1）中所得的基材溶液与木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶浆状物混合，在0-35℃振荡混合1-60min，得到混合悬浊液；（3）将（2）所得的混合悬浊液与聚丙烯酰胺溶液混合，震荡1-60min；（4）将（3）中所得的固定化木瓜蛋白酶洗涤后冷冻干燥即得。本发明具有固定化木瓜蛋白酶固定化效率高、酶活回收率高，操作简便，条件温和等优点。
【专利说明】一种木瓜蛋白酶制剂及固定化方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种木瓜蛋白酶固定化方法及酶制剂。
【背景技术】
[0002]纤维素是世界上最丰富的天然高分子聚合物之一，对纤维素的高附加值利用是国内外的研究热点。纤维素纳米晶体具有闻结晶度，闻机械强度，大比表面积等性能，在食品、医药、生物(酶的固定化)、新能源等领域有较好的应用前景。
[0003]目前酶固定化方法常用的用双功能团试剂对酶和载体进行交联，如戊二醛、甲醛、以及二亚胺类试剂，其中二醛类交联剂成本较低，但反应激烈，酶与载体质量比低(18.Smg(酶)/g (载体)Gulay Bayramoglu, B.Filiz Senkal, Meltem Yilmaz, M.Yakup Arica.1mmobilization and stabilization of papain on poly (hydroxyethyl methacrylate -ethylenglycol dimethacrylate)beads grafted with epoxy functional polymerchains via surface-1nitiated-atom transfer radical polymerization (S1-ATRP).Bioresource Technology.Volumel02, Issue21, 2011, 9833 - 9837),酶固定化效率不高，增加了制备成本，另一方面，二亚胺类试剂价格较高，交联时间较长(12_24h活化，2h交联)，步骤繁复(Khaled A.Mahmoud, Edmond Lam, Sabahudin Hrapovic, and John H.T.Luong.Preparation of Well-Dispersed Gold/Magnetite Nanoparticles Embedded onCellulose Nanocrystals for Efficient Immobilization of Papain Enzyme.ACS App1.Mater.1nterfaces2013, 5,4978-4985)。因此，有必要发明一种操作简单，酶固定化效率高，反应条件温和的反应。
【发明内容】
`[0004]本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种简单的基于静电自组装技术的固定化方法，形成了纤维素基材-酶-丙烯酰胺三层结构的固定化酶。
[0005]一种木瓜蛋白酶固定化方法，包括如下步骤:
[0006]( I)将纤维素纳米晶基材分散在pH为5-9的缓冲溶液中，配置成基材溶液；
[0007](2)将(I)中所得的基材溶液与木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶浆状物混合，在0-35°C振荡混合l_60min,得到混合悬池液；
[0008](3)将(2)所得的混合悬浊液与聚丙烯酰胺溶液混合，震荡l_60min ；
[0009](4)将(3)中所得的固定化木瓜蛋白酶洗涤后冷冻干燥即得。
[0010]所述步骤(1)中的纤维素纳米晶基材为将纤维素材料通过硫酸水解所得到纤维素纳米晶体。
[0011]所述聚丙烯酰胺与木瓜蛋白酶的质量比为0.11~2。
[0012]所述木瓜蛋白酶与基材的质量比为1: (10-100)。
[0013]所述步骤(2)、(3)中震荡速率为100_500rpm。
[0014]所述步骤(2)中木瓜蛋白酶包括木瓜蛋白酶酶粉、胞外产木瓜蛋白酶或细胞破壁后含木瓜蛋白酶的发酵液。
[0015]所述纤维素材料为微晶纤维素、纤维素纤维和棉花中的一种或两种以上。
[0016]本发明原理:纤维素材料经过硫酸水解生成纤维素纳米晶后，其表面糖链上的活性羟基部分被酸(优选硫酸)酯化，因酸根带有负电荷，因此，酸水解纤维素纳米晶表面带有负电荷。木瓜蛋白酶在ph〈7时，酶蛋白表面带有部分正电荷，在水溶液中，能与带负电荷的纤维素纳米晶发生静电自组装，形成表面带部分正电荷的酶-纤维素纳米晶复合物。聚丙烯酰胺在PH5-9范围内带有负电荷，能与上述带部分正电荷的酶-纤维素纳米晶复合物再一次发生静电自组装，从而实现酶的固定化。
[0017]本发明相对于具有以下优点:
[0018](I)发明使用简单的静电自组装技术，在固定化酶过程中不使用戊二醛、甲醛等双功能试剂，成本较低，反应温和，能够较大程度保持酶活(60%~99%)，提高酶活回收率，固定化效果好，操作简便。
[0019](2)本发明的固定化木瓜蛋白酶方法，能够用于木瓜蛋白酶、过氧化物酶等一系列在pH2_10下zeta电位为正的酶,并具有作为蛋白质药物载体的潜质。
【专利附图】
【附图说明】
[0020]图1为实施例2中所得到的酶制剂在不同pH之下的相对酶活。
[0021]图2为实施例2中所得到的酶制剂在不同温度下的相对酶活。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
`[0023]实施例1
[0024]将80mg纤维素纳米晶分散在4ml pH5的磷酸缓冲溶液中，加入4ml含有3.298mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震荡60min，加入0.5ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率200rpm下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶效率为98.40%，产品中木瓜蛋白酶与纤维素纳米晶基材比例为41.22mg/g。
[0025]实施例2
[0026]将563.2mg纤维素纳米晶分散在25ml pH5.5缓冲溶液中，加入20ml含有57.994mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震荡30min，加入6ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率200rpm下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品，酶活回收率65.3%。
[0027]实施例3
[0028]将80mg纤维素纳米晶分散在4ml pH6.0缓冲溶液中，加入4ml含有3.297mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震荡30min，加入0.3ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在35°C、速率200rpm下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶效率为
97.60%，酶与纤维素纳米晶基材比例为40.23mg/g。
[0029]实施例4
[0030]将80mg纤维素纳米晶分散在4ml pH5的磷酸缓冲溶液中，加入4ml含有2.268mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率IOOrpm下震荡lOmin，加入0.1ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在30°C、速率IOOrpm下震荡50min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶效率为75.21%，产品中木瓜蛋白酶与纤维素纳米晶基材比例为21.32mg/g。
[0031]实施例5
[0032]将80mg纤维素纳米晶分散在4ml pH5.5缓冲溶液中，加入4ml含有2.268mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震荡20min，加入0.1ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在20°C、速率200rpm下震荡40min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶效率为67.22%，酶与纤维素纳米晶基材比例为19.06mg/g。
[0033]实施例6
[0034]将80mg纤维素纳米晶分散在4ml pH6.5缓冲溶液中，加入4ml含有3.297mg木瓜蛋白酶溶液，在30°C、速率200rpm下震荡60min，加入0.3ml0.5%聚丙烯酰胺水溶液，在35°C、速率200rpm下震荡30min，洗涤后冷冻干燥得到固定化酶产品。固定化酶效率为
98.47%，酶与纤维素纳米晶基`材比例为40.59mg/g。
【权利要求】
1.一种木瓜蛋白酶固定化方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将纤维素纳米晶基材分散在PH为5-9的缓冲溶液中，配置成基材溶液； (2)将(I)中所得的基材溶液与木瓜蛋白酶溶液或木瓜蛋白酶浆状物混合，在0-35°C振荡混合l_60min,得到混合悬池液； (3)将(2)所得的混合悬浊液与聚丙烯酰胺溶液混合，震荡l-60min； (4)将(3)中所得的固定化木瓜蛋白酶洗涤后冷冻干燥即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的纤维素纳米晶基材为将纤维素材料通过硫酸水解所得到纤维素纳米晶体。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述聚丙烯酰胺与木瓜蛋白酶的质量比为0.11~2。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述木瓜蛋白酶与基材的质量比为 1: (10-100)。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)、(3)中震荡速率为100_500rpm。
6.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中木瓜蛋白酶包括木瓜蛋白酶酶粉、胞外产木瓜蛋白酶或细胞破壁后含木瓜蛋白酶的发酵液。
7.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述纤维素材料为微晶纤维素、纤维素纤维和棉花中的一种或两种以上。
8.根据权利要求1~7任意一项`方法制备的木瓜蛋白酶制剂。
【文档编号】C12N11/08GK103756990SQ201410009414
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月8日 优先权日:2014年1月8日
【发明者】娄文勇, 宗敏华, 曹诗林, 黄宇美 申请人:华南理工大学