偶发分枝杆菌及在发酵生产δ-内酯中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株发酵生产雌酚酮和雌二醇及其衍生物的中间体δ-内酯的偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCCM2013543。采用CCTCCM2013543可将植物甾醇降解为δ-内酯,并将其排除细胞外，积累下来，重量收率可达到32%~39%，可大量累集δ-内酯，并且杂质种类少，生产成本大幅降低。
【专利说明】偶发分枝杆菌及在发酵生产S-内酯中的应用
[0001]发明所属领域:
[0002]本发明涉及一株生产留体激素的菌株，具体地说，本发明涉及一株发酵生产雌酚酮和雌二醇及其衍生物的中间体δ -内酯的偶发分枝杆菌株，含有菌株的菌剂及应用。
【背景技术】:
[0003]微生物在留体化合物转化中的应用已有了大量的研究工作及文献记载。1937年，Mamoli和Vercellone发现,应用细菌发酵就可完成对17-酮类固醇到17 β-羟基甾体的转化。接着Peterson与Murray发现，真菌Rhizopus nigricans可在黄体酮的轻基化中起作用(U.S.Pat.N0.2602769(1952))。之后，Kraychy等人在美国专利U.S.Pat.N0.3684657 (1972))上公开了分枝杆菌 Mycobacterium sp.NRRLB-3683 可选择性切除17-烷基甾体上8个碳原子以上的侧链，从而得到4-AD，ADD以及20α-羟甲基-孕甾-1, 4- 二烯-3-酮。1973 年，Marsheck 等人(U.S.Pat.N0.3759791)发现 4-雄烯-3，17- 二酮的产生还有另一条途径，即利用分枝杆菌Mycobacterium sp.NRRLB-3805对17侧链上含有8个碳原子以上的胆留烷或豆留烷进行微生物发酵。
[0004]Wang 和 Sih (Biochem.2:1238-1243，1963.)研究发现，δ -内酯(英文名sitolactone)是局限诺卡菌Nocardia restrictus在对4_雄烯-17 β醇_3_酮进行微生物降解过程中产生的中间产物。同年，John C.Knight等在专利U.S.Pat.4042459中阐述了用偶发分枝杆菌株M.fortuitum NRRL B-8128制备δ -内酯的方法，但该方法得到的产物种类过多，杂质多，sitolactone收率低，重量收率仅为4.5%，生产成本高，难产业化。
[0005]δ -内酯，英文名sitolactone是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，但转化过程中留核A环，B环开环，非常容易降解，产品难以积累，从而难以达到产业化标准。
[0006]发明技术内容:
[0007]本发明的第一个目的是提供一株偶发分枝杆菌突变株，使用该突变株，可将植物甾醇转化为S-内酯，且能有效的抑制δ-内酯留核A环，B环开环，进而抑制了其降解，使S-内酯得以积累。
[0008]本发明的第二个目的是提供一种含有偶发分枝杆菌突变株的液体菌剂。
[0009]本发明的第三个目的是提供偶发分枝杆菌突变株及菌剂在发酵生产δ-内酯中的应用。
[0010]本发明的第四个目的是提供发酵生产δ-内酯的方法。
[0011]本发明公开了一株偶发分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)突变株NK-XHX-103,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543,保藏日期是2013年11月04日。
[0012]本发明中公开的偶发分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)突变株NK-XHX-103,CCTCC M2013543通过如下方式得到:
[0013]菌种分离:本发明人在堆积植物留醇场地附近的土壤中取样，活化后使用含固体蛋白胨培养基划线培养，观察菌落形态，选择菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微观察菌体尺寸一般较其他细菌小的菌落再培养，使用液体的蛋白胨培养基在30°C，180rpm 培养。
[0014]菌种诱导:当菌体密度生长至5X IO8个/ml，离心，菌体用无菌柠檬酸钠溶液冲洗，并用柠檬钠溶液将菌体稀释到原来的体积，再加入亚硝基胍，菌悬液37°C水浴半小时。再次离心，菌体用磷酸缓冲液冲洗。并重新在磷酸缓冲液中悬浮分散。
[0015]菌株筛选:将诱变后的菌悬液进行稀释涂布初筛固体培养基上，于30°C培养7天。挑取单菌落接种到复筛固体培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的培养纯化，得到诱变后的菌株。
[0016]菌种摇瓶转化:将诱变后的菌株接种到液体种子培养基上，30°C，每分钟180rpm培养72小时，再接种到转化培养基中，接种量20%，在30°C，每分钟220rpm，转化培养72小时，取样送液相检测，根据液相结果确定目标菌株优劣。
[0017]经过以上诱变筛选工作，得到一株优秀的变异菌株，将之命名为偶发分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543，保藏日期是2013年11月04日。
[0018]偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543有如下特征:在不同生长环境下，菌体呈现不同形态，但基本上为杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸一般较其他细菌小，通常为长0.7~1.0微米，宽0.3~0.4微米。可将植物甾醇降解为S-内酯，并将其排除细胞外，积累下来，重量收率可达到32%~39%，达到产业化标准。
[0019]本发明的发酵反应如附图1所示。
`[0020]本发明还公开了含有偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCC M2013543的液体菌剂，按重量计，该菌剂的含生物量是0.5%~1%，余量为培养过偶发分枝杆菌突变株的培养基。
[0021]本发明还公开了制备偶发分枝杆菌突变株及其菌剂的方法。生产菌剂的方法包括下列步骤:
[0022]A斜面种子培养JfCCTCC M2013543接种到固体蛋白胨斜面培养基上，28_32°C培养;
[0023]B液体种子培养:从斜面刮取菌体，接种到蛋白胨液体培养基中，28_32°C培养；
[0024]C计数:按重量计，含菌生物量是0.5%~1%，余量为培养过CCTCC M2013543的培养基，得液体菌剂；
[0025]其中:斜面固体蛋白胨培养基组分是:蛋白胨3_7g/L，牛肉膏1.25-1.75g/L，酵母膏 1.25-1.75g/L，葡萄糖 3-7g/L，氯化钠 3_7g/L，琼脂 15_25g/L，余量为水，pH=7.5 ；
[0026]液体蛋白胨培养基组分是:蛋白胨0.25-0.75g/L，牛肉膏0.125-0.175g/L，酵母膏 0.125-0.175g/L，葡萄糖 0.25-0.75g/L，氯化钠 0.25-0.75g/L，余量为水，pH=7.5。
[0027]本发明还公开了偶发分枝杆菌突变株及其菌剂在发酵生产δ -内酯中的应用。
[0028]本发明还公开了生产δ -内酯的方法，该方法包括下列步骤:
[0029]①发酵培养:将液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为19~21%，转化温度为28~32°C，发酵培养的转速为180-500rpm/min，空气流量为0.18~0.22Nm3/h，罐压0.045 ~0.055MPa ；
[0030]②分离提取:用氢氧化钠溶液调节pH为8.9-9.1，搅拌，分层，取水层，加硫酸调节pH为1.9-2.1,用氯仿萃取,浓缩,得δ-内酯；
[0031]其中转化培养基组分为:硝酸钠6.3-6.4g/L，磷酸二氢钾0.9-1.lg/L，磷酸二氢钠 1.9-2.lg/L，七水硫酸镁0.7-0.9g/L，氯化钾 0.1-0.3g/L，葡萄糖 5_7g/L，蛋白胨 8_12g/L，大豆油12%，植物甾醇2%，营养液I 0.8-1.2ml，营养液II 0.8-1.2ml，余量为水；
[0032]在本发明中，植物留醇是玉米留醇、大豆留醇、木留醇或菜籽留醇中的一种或多种；
[0033]在本发明中，营养液I组份为:硫酸锌10_12g/L，硫酸镁ll_13g/L，氯化钙0.2-0.4g/L，氯化镍 0.1-0.3g/L，硫酸铜 0.03-0.05g/L,硼酸 0.02-0.04g/L,碘化钾
0.005-0.015g/L，余量为水；
[0034]营养液II组份为:氯化铁0.8-1.2g/L，EDTA3_7g/L，余量为水。
[0035]在本发明中，δ -内酯是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，英文名sitolactone, CAS 号:64053-02-7。CAS 是 Chemical Abstracts Service,美国化学文摘服务社，美国化学会(American Chemical Society)下属组织。CAS号是美化学文摘社为每一种出现在文献中的物质分配一个的号码。在本发明中，δ-内酯就是sitolactone，sitolactone 就是 δ -内酯。
[0036]本发明中涉及的微生物菌种，偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103, (mycobacteriumfortuitum NK-XHX-103)保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC M2013543,保藏日期是2013年11月04日。菌种处于专利保护状态，研究者可从保藏机构索取，中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话:027-68752319, Email:cctcciwhu.e`du.cn。
[0037]对比菌株M.fortuitum NRRL B-8128保藏于美国农业研究菌种保藏中心NRRL(Agricultural Research Service Culture Collection),位于伊利诺伊州皮契里亚，菌种处于公开状态，研究者可从保藏机构索取。
[0038]本发明与现有技术相比，有下列优点:
[0039]1.本发明利用油水两相体系，使用偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103，CCTCCM2013543成功将植物甾醇转化为δ-内酯，有效的抑制了 δ -内酯中甾核A环，B环开环，进而抑制了其降解，使产品得以积累，提高了收率，重量收率可达到32%~39%。
[0040]2.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103与菌株Μ.fortuitum NRRLB-8128比不仅可将植物留醇降解为S-内酯，并排除细胞外，积累下来，转化过程中主要产物是δ-内酯，其他杂质种类少，量少，产品收率相对较高，相较Μ.fortuitum NRRL B-8128在制备sitolactone的重量收率提升8.56倍。
[0041]3.生产成本降低:偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103转化过程中主要产物是δ -内酯，生产成本为:460~560元/kg，与菌株M.fortuitum NRRL B-8128发酵相比，降低生产成本6.7倍。
【专利附图】
【附图说明】
[0042]图1是生物发酵反应示意图[0043]A表示植物植物甾醇，B表示δ -内酯
[0044]图2是发酵产物的高效液相色谱图
【具体实施方式】
[0045]下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。
[0046]实施例1.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103的筛选与获得 [0047]1.1菌种分离:在本工厂堆积植物留醇场地附近的土壤中取样，活化后使用含固体蛋白胨培养基划线培养，观察菌落形态，选择菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，显微观察菌体尺寸一般较其他细菌小的菌落。将挑选合格菌落使用液体的蛋白胨培养基在30°C培养，转速每分钟是180rpm下培养。
[0048]固体蛋白胨培养基配方及配制方法:
[0049]蛋白胨3g/L，牛肉膏1.25g/L，酵母膏1.25g/L，葡萄糖7g/L，氯化钠3g/L，分别称量以上物质，加入蒸馏水中，搅拌溶解，PH值用10%氢氧化钠溶液调至7.5，加入2%琼脂粉，加热溶清，如制备斜面，溶清后分装到试管中，121°C灭菌30分钟，冷却到80°C，摆放斜面或倒平板，冷却到室温，30°C培养48小时，无菌落出现则可用。
[0050]液体蛋白胨培养基配方及配制方法:蛋白胨0.75g/L，牛肉膏0.175g/L，酵母膏0.125g/L，葡萄糖0.75g/L，氯化钠0.75g/L，pH值用10%氢氧化钠溶液调至7.5，用水定容至I升，121°C灭菌30分钟。
[0051]1.2菌体诱变:当菌体密度生长至5X IO8个/ml，离心，菌体用pH=5.6,0.lmol/L无菌柠檬酸钠溶液冲洗，并用柠檬钠溶液将菌体稀释到原来的体积，再加入亚硝基胍，亚硝基胍浓度是60 μ g/m,菌悬液在37°C水浴半小时。再次离心，菌体用等量的0.lmol/L, pH=7的磷酸缓冲液冲洗，菌体重新在0.lmol/L, pH=7的磷酸缓冲液中悬浮分散。
[0052]1.3菌株筛选:将诱变后的菌悬液进行稀释涂布，培养基采用初筛培养基，于30°C培养7天。挑取单菌落接种到复筛培养基中，凡是在复筛培养基中不能生长的菌体，用初筛培养基进行进一步的培养纯化，得到诱变后的菌株。
[0053]初筛培养基配方及配置方法是:葡萄糖1%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%,七水硫酸亚铁0.005%,琼脂2%，pH=7.5.培养基121°C灭30min。
[0054]复筛培养基配方及配置方法是:δ-内酯0.2%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾
0.4%，七水硫酸镁0.03%,七水硫酸亚铁0.005%,琼脂2%，ρΗ=7.5。培养基121。。灭30min。
[0055]1.4菌种摇瓶转化测试:将诱变后的菌株接种到液体种子培养基上，30°C，180rpm/min培养72小时，再接种到转化培养基中，接种量20%，在30°C，220rpm/min,转化培养72小时，取样送液相检测，根据液相结果确定目标菌株优劣。
[0056]液体种子培养基配方及配置方法是:葡萄糖1%，酵母膏0.6%，磷酸氢二钠0.4%，磷酸二氢钾0.4%，七水硫酸镁0.03%,七水硫酸亚铁0.005%, pH=7.5.培养基121°C灭30min。
[0057]转化培养基配方及配置方法:硝酸钠6.4g/L，磷酸二氢钾0.9g/L，磷酸二氢钠
1.9g/L，七水硫酸镁0.9g/L，氯化钾0.3g/L，葡萄糖5g/L，蛋白胨8g/L，大豆油12%，粉末状β -环糊精2%，植物甾醇0.5%，营养液I 0.8-1.2ml，营养液II 0.8-1.2ml，余量为水；
[0058]经过以上诱变筛选工作，得到一株优秀的变异菌株，将之命名为偶发分枝杆菌(mycobacterium fortuitum)突变株NK-XHX-103，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC Μ2013543，保藏日期是2013年11月4日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话:027_68752319，Emailicctcciwhu.edu.cn。
[0059]偶发分枝杆菌(mycobacteriumfortuitum)突变株 NK-XHX-103, CCTCC M2013543有如下特征:在不同生长环境下，菌体呈现不同形态，但基本上为杆状，菌落表面粗糙，边缘不规则，颜色为灰白色或淡黄色，菌体尺寸一般较其他细菌小，通常为长0.7-1.0微米，宽0.3-0.4微米。可将植物留醇降解为sitolactone，并将其排除细胞外，积累下来。
[0060]实施例2.偶发分枝杆菌突变株NK-XHX-103及菌剂制备方法
[0061]2.1斜面培养基的配制:
[0062]
【权利要求】
1.一株偶发分枝杆菌(jnycobacterium fortuiturn)突变株NK-XHX-103,保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC Μ2013543。
2.一种含有权利要求1中突变株的液体菌剂，按重量计，该菌剂含生物量是0.5%~I余量为培养过CCTCC Μ2013543的培养基。
3.一种制备权利要求2中液体菌剂的方法，该方法包括下列步骤: A斜面种子培养:将CCTCC Μ2013543接种到固体蛋白胨斜面培养基上，28-32°C培养； B液体种子培养:从斜面刮取菌体，接种到蛋白胨液体培养基中，28-32°C培养； C计数:按重量计，含菌生物量是0.5%~1%，余量为培养过CCTCC M2013543的培养基，得液体菌剂； 其中:斜面固体蛋白胨培养基组分是:蛋白胨3-7 g/L，牛肉膏1.25-1.75g/L，酵母膏.1.25-1.75 g/L，葡萄糖 3-7g/L，氯化钠 3_7g/L，琼脂 15_25g/L，余量为水，pH=7.5 ； 液体蛋白胨培养基组分是:蛋白胨0.25-0.75 g/L，牛肉膏0.125 -0.175g/L，酵母膏.0.125 -0.175 g/L，葡萄糖 0.25-0.75g/L，氯化钠 0.25-0.75 g/L，余量为水，pH=7.5。
4.权利要求1中的突变株在发酵生产δ-内酯中的应用。
5.权利要求2中的菌剂在发酵生产δ-内酯中的应用。
6.一种生产δ-内酯的方法，该方法包括下列步骤: ①发酵培养:将液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为19~21%，转化温度为28~32°C，发酵培养的转速为180-500rpm/min，空气流量为0.18~0.22Nm3/h,罐压为0.045 ~0.055MPa ； ②分离提取:用氢氧化钠溶液调节PH为8.9-9.1，搅拌，分层，取水层，加硫酸调节pH为1.9-2.1，用氯仿萃取，浓缩，得δ-内酯； 其中转化培养基组分为:硝酸钠6.3-6.4g/L，磷酸二氢钾0.9-1.lg/L，磷酸二氢钠.1.9-2.1 g/L，七水硫酸镁 0.7-0.9 g/L，氯化钾 0.1-0.3 g/L，葡萄糖 5-7 g/L，蛋白胨 8-12g/L，大豆油12%，植物甾醇2%，营养液I 0.8-1.2ml，营养液II 0.8-1.2ml，余量为水； 植物留醇是玉米留醇、大豆留醇、木留醇或菜籽留醇中的一种或多种； 营养液I组份为:硫酸锌10_12g/L，硫酸镁11-13 g/L,氯化钙0.2-0.4 g/L,氯化镍.0.1-0.3 g/L，硫酸铜 0.03-0.05 g/L，硼酸 0.02-0.04 g/L，碘化钾 0.005-0.015 g/L，余量为水； 营养液II组份为:氯化铁0.8-1.2 g/L, EDTA 3-7 g/L，余量为水。
7.根据权利要求6中的方法，该方法包括下列步骤: ①发酵培养:将液体菌剂接种到转化培养基中培养，接种量为20%,于30°C，180rpm/min转化，转化48小时，空气流量为0.20Nm3/h,罐压为0.050MPa ； ②分离提取:取样，簿层色谱(TLC)点板检测，转化完全，用氢氧化钠溶液调pH=9，充分振荡混匀，分层，取水层，加硫酸酸化至pH=2，用I体积的氯仿萃取3次，将氯仿层浓缩干，得δ -内酯； 其中转化培养基配方为硝酸钠6.32g/L，磷酸二氢钾lg/L，磷酸二氢钠2.1 g/L，七水硫酸镁0.9 g/L,氯化钾0.2 g/L,葡萄糖6 g/L，蛋白胨10 g/L,大豆油12%，外标含量95%玉米甾醇2%，营养液I 1.1ml，营养液II 1.1ml，余量为水； 其中营养液I组份为:硫酸锌12g/L，硫酸镁11 g/L，氯化钙0.4g/L，氯化镍0.3 g/L,硫酸铜0.05 g/L，硼酸0.03 g/L，碘化钾0.01 g/L,余量为水；营养液II组份 为:氯化铁1.1 g/L, EDTA 6 g/L,余量为水。
【文档编号】C12P17/06GK103756940SQ201410029845
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】刘喜荣, 孟浩 申请人:湖南新合新生物医药有限公司