一种猪克隆胚胎的制备方法
【专利摘要】本发明属于生物工程【技术领域】，公开了一种猪克隆胚胎的制备方法。该制备方法包括：获得供体细胞；取重编程因子重组载体，转入所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。本发明提供的制备方法在获得核供体细胞之后直接移植到去除细胞核的卵细胞中，缩减了利用重编程因子制备猪克隆胚胎的步骤，操作简单易行，缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率。
【专利说明】一种猪克隆胚胎的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，特别涉及一种猪克隆胚胎的制备方法。
【背景技术】
[0002]克隆猪在畜牧业生产、基础科学和医学研究中具有重要的应用价值，例如，在畜牧业生产上可以保种和丰富猪品种；在医学研究中猪可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。目前，广泛用于制备克隆猪的技术为体细胞克隆技术。
[0003]体细胞克隆技术是指采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将核供体移入核受体中构建重组胚胎，供体核在去核卵母细胞的胞质中被重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育，获得克隆动物的技术，也称为体细胞核移植技术。传统理论上认为，分化和发育是一个不可逆的过程，在这个过程中，细胞从全能的状态逐步分化成具有较低潜能的状态，表达特定的基因以执行特定的功能。体细胞克隆则与之相反，它需要细胞从低潜能的分化状态转变成具有较高发育潜能的胚胎状态并使其随后发育成动物个体，这个过程即为细胞核重编程(nuclear reprogramming)。体细胞克隆中的细胞核重编程包括两个步骤:首先，使分化的供体细胞去分化以达到全能的胚胎状态；接着在随后的发育过程中使克隆胚胎再分化成不同的体细胞类型。
[0004]细胞核重编过程包括了基因表达模式的改变和表观遗传标记的改变。在体细胞克隆中，卵母细胞首先必须擦除供体细胞核中的分化记忆并建立类似胚胎的全能状态，这个过程需要表观遗传重编(epigenetic reprogramming)以擦除体细胞核中原先的表观遗传模式并在克隆胚胎中建立胚胎的表观遗传特性和基因表达模式。目前的观点认为，表观遗传重编不完善是导致克隆 胚胎发育失败、胚胎发育效率较低和表型异常的主要因素。因此，植入前胚胎期的表观遗传重编程对于正确的发育是至关重要的，它能够调节早期胚胎基因表达、细胞分裂进而决定细胞命运。某些重编程因子在该表观遗传重编过程中发挥重要的作用，例如重编程因子 0ct4、Sox2、c-Myc、Klf4、Lin28 和 Nanog0 研究发现 0ct4、Sox2、c-Myc和Klf4基因就足以将成纤维细胞重编成为胚胎干细胞样细胞。因此，重编程因子目前被研究者用于体细胞克隆技术中，来提高克隆胚胎重编程能力进而提高克隆胚胎发育效率。
[0005]利用体细胞克隆技术制备克隆猪的步骤可分为两大步骤:步骤一为获得克隆胚胎；步骤二为将胚胎移植入合适的受体猪进行进一步的发育，至克隆猪的出生。其中，将重编程因子应用于制备猪克隆胚胎的具体操作流程包括:含重编程因子载体的构建；供体细胞的转染；含重编程因子基因的核供体细胞的筛选；核体细胞核移植；体外培养，即得。目前，研究认为采用重编程因子来提高克隆胚胎发育效率时，需要将重编程因子整合到供体细胞的基因组中以有效提高克隆胚胎中重编程因子的水平，这需要在供体细胞转染含重编程因子载体之后，还需要对供体细胞进行进一步培养、筛选以获得整合了重编程因子基因的核供体细胞，造成整操作流程复杂、工作周期较长，不利于克隆猪的推广和应用。
【发明内容】
[0006]有鉴于此，本发明的发明目的在于提供一种猪克隆胚胎的制备方法，该制备方法操作步骤少、操作简单、缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率，更有利于克隆猪的推广和应用。
[0007]为了实现本发明的发明目的，本发明采用如下技术方案:
[0008]本发明提供了一种猪克隆胚胎的制备方法，包括以下步骤:
[0009]步骤1:获得供体细胞；
[0010]步骤2:取重编程因子重组载体，转入步骤I所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。
[0011]目前，研究者为了提高克隆胚胎中重编程因子的水平，采用在将重编程因子基因转入供体细胞之后，进行进一步的培养、筛选以获得整合了重编程因子基因的核供体细胞。但是，研究发现，并不是核供体细胞中重编程因子基因整合的量越多胚胎发育效率越高，相反有些实验中供体细胞在转入重编程因子基因后反而不利于胚胎的发育，这可能是由于重编程因子持续大量表达干扰了胚胎的正常发育造成的，因为供体细胞被重编程过程中需要大量的重编程因子，而在之后的胚胎发育过程中需要下调重编程因子表达水平。本发明提供的制备方法采用将重编程因子重组载体转入供体细胞之后，直接将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，既 提高了克隆胚胎中重编程因子的水平，又避免了外源重编程因子基因被整合到基因组中，实现了在克隆胚胎一细胞期提供高水平的重编程因子，促进卵细胞细胞质启动重编程程序，进行核供体细胞核重编程，而随着胚胎发育中细胞有丝分裂的进行，转入的重编程因子重组载体浓度逐渐被稀释，有效地降低了细胞中外源的重编程因子的含量，更有利于克隆胚胎的正常生长，有效提高了克隆胚胎发育效率。
[0012]优选地，本发明提供的制备方法中，步骤2中转入具体为:
[0013]取重编程因子重组载体与步骤I所得供体细胞混合，于_4°C~4°C条件下孵育5min ~IOmin0
[0014]本发明采用将重编程因子重组载体与供体细胞在_4°C~4°C条件下共孵育的方法，将重编程因子重组载体转入供体细胞或者吸附在供体细胞膜表面上，在之后的核移植时，供体细胞作为运输载体将转入供体细胞内或者吸附在供体细胞膜表面上的重编程因子重组载体转入了去除细胞核的卵细胞中，提高了克隆胚胎中重编程因子的水平，且该转入方法步骤少、操作简单易行。
[0015]优选地，本发明提供的制备方法步骤2混合所得的混合液中重编程因子重组载体的浓度为20ng/ μ L~80ng/ μ L。
[0016]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2混合所得的混合液中重编程因子重组载体的浓度为50ng/y L。
[0017]优选地，本发明提供的制备方法步骤2孵育的时间为5min。
[0018]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2转入供体细胞之后，还包括，将所得重编程因子与供体细胞的孵育液加入到3倍体积的37°C~39°C的胚胎操作液中，得核供体细胞。所得核供体细胞所处于37°C~39°C的环境中，更有利于移植后所得克隆胚胎的成活和发育。[0019]优选地，本发明提供的制备方法步骤2中移植具体为:
[0020]取步骤I所得供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞。
[0021]优选地，本发明提供的制备方法步骤2中去除细胞核的卵细胞的制备方法为用显微注射针取出卵母细胞第一极体和纺锤体，即得。
[0022]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中去除细胞核的卵细胞的制备方法具体为用显微注射针取出卵母细胞第一极体和第一极体附近的体积百分比为15% -20%的细胞质，即得。
[0023]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法中步骤2中移植具体为:在取出卵母细胞第一极体和纺锤体的同一位置，向所得去除细胞核的卵细胞中注入所述核供体细胞。
[0024]优选地，本发明提供的制备方法步骤I中供体细胞包括猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞。本发明提供的制备方法步骤I中的供体细胞优选为猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞，但不限于以上供体细胞，本领域技术人员明显可以根据需求而获得其他供体细胞，包括经过基因修饰的供体细胞。
[0025]在本发明的一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤I中供体细胞为猪胎儿成纤维细胞。
[0026]优选地，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子包括0ct4、Klf4、c-Myc,Sox2、Lin28或Nanog中的一种或者两者以上混合物。
[0027]更为优选地，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为0ct4或Nanog中的一种或者两者的混合物。
[0028]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为0ct4o
[0029]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子为h0ct4o
[0030]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法步骤2中重编程因子重组载体具体为 pLv-CMV-ZsGreen_h0ct4 质粒。
[0031]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法包括以下步骤:
[0032]步骤1:获得供体细胞；
[0033]步骤2:取重编程因子重组载体，与步骤I所得供体细胞混合，于_4°C~4°C条件下孵育5min~IOmin之后，加入到3倍体积的37°C~39°C的胚胎操作液中，得核供体细胞；将所得核供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞，融合和激活，即得。
[0034]在本发明的另外一些实施例中，本发明提供的制备方法具体为:
[0035]获得猪胎儿成纤维细胞；
[0036]取pLv-CMV-ZsGreen_h0ct4质粒与所得猪胎儿成纤维细胞混合,使所得混合液中pLv-CMV-ZsGreen-h0ct4 质粒的终浓度为 50ng/ μ L ；
[0037]将所得混合液于_4°C~4°C条件下孵育5min之后，加入到38.5°C预热的3倍体积的胚胎操作液中，得核供体细胞；
[0038]在38.5°C条件下，将所得核供体细胞，用显微注射针注入去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。[0039]本发明提供了一种猪克隆胚胎的制备方法。该制备方法包括以下步骤:获得供体细胞；取重编程因子重组载体，转入所得供体细胞，得核供体细胞；将所得核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。本发明提供的制备方法在获得核供体细胞之后直接移植到去除细胞核的卵细胞中，缩减了利用重编程因子制备猪克隆胚胎的步骤，操作简单易行，缩短了工作周期，且有效提高了猪克隆胚胎发育效率。实验结果证实，本发明提供的猪克隆胚胎的制备方法制备得猪克隆胚胎的囊胚率显著提高，且不影响克隆胚胎的分裂率，说明本发明提供的制备方法有效提高了猪克隆胚胎发育效率，更有利于克隆猪的推广和应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0040]图1示本发明提供的猪克隆胚胎制备方法流程图；
[0041]图2示荧光显微镜下检测实施例1制得的核供体细胞获得的结果；其中，核供体细胞代表实施例1制得的核供体细胞；
[0042]图3示不同组别胚胎发育效率，同组数据中不同的字母a、b代表差异显著；
[0043]图4示不同组别制得的猪克隆胚胎发育到第7天的囊胚数目检测结果(4x)和囊胚细胞数目检测结果(IOOx) ;A代表不同组别克隆胚胎在体式显微镜下的情况出为不同组别DAPI染色后观察得到的单个囊胚中的囊胚细胞数(IOOx)，其中白色代表蓝色，该蓝色为DAPI染色后观察到细胞核的颜色；
[0044]图5示不同组别囊胚中细胞凋亡情况；其中PC代表凋亡阳性对照，胚胎经过DNA酶处理；DAPI代表采用DAPI染色法统计不同组别胚囊中细胞情况(细胞染色为蓝色)，反映了每个组别囊胚中平均细胞数；TUNEL代表采用TUNEL法检测细胞凋亡情况(细胞染色为绿色)；Merge代表将DAPI染色法统计到的细胞情况与采用TUNEL法检测细胞凋亡情况组合到一张图片上所对应的结果；
`[0045]图6示囊胚期不同组别的克隆胚胎平均细胞凋亡数统计图；
[0046]图7示实验组胚胎在荧光显微镜下检测结果；
[0047]图8示不同组别制得的克隆胚胎一细胞期和囊胚期外源性0ct4基因的相对表达量检测结果；
[0048]图9示不同组别制得的克隆胚胎一细胞期和囊胚期内源性0ct4基因的相对表达量检测结果。
【具体实施方式】
[0049]本发明公开了一种猪克隆胚胎的制备方法。本领域技术人员可以参考本文内容，实施该制备方法，获得猪克隆胚胎，特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明内。本发明的制备方法已经通过较佳的实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文制备方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0050]本发明提供的一种猪克隆胚胎中所用到的试剂和原料均可由市场购得。
[0051]材料和试剂的配置:
[0052]细胞培养基:DMEM高糖培养基，胎牛血清(FBS)，购自GIBCO公司。[0053]胰酶:0.25 % Trypsin-EDTA,购自 GIBCO 公司。
[0054]DPBS缓冲液:2.68mmol/L KCl, 2.0OmmoI/L KH2PO4,136.89mmol/L NaCl，IOmmoI/LNa2HPO4,0.06g/L 青霉素，0.05g/L 链霉素。
[0055]孵育液:质量体积百分比2.8%柠檬酸钠，溶剂为100mmol/L EDTA, pH7.4。
[0056]质粒pLv-CMV-ZsGreen_h0ct4:购自百恩维生物科技有限公司，携带有人0ct4基因序列，Genbank:NM_002701.4，由中山大学生命科学学院动物遗传工程实验室保藏。
[0057]TL-HEPES-PVA(洗卵液):114mmol/L NaCl, 3.2mmol/L KC1，0.34mmol/L NaH2PO4,lOmmol/L 乳酸纳，0.5mmol/L MgCl2_6H20, lOmmol/L HEPES(4-轻乙基喊嚷乙横酸)，0.2mmol/L 丙丽酸纳，12mmol/L 山梨醇，2mmo1 /T, NaHCO3, 2mmol/L CaCl2_2H20, 25 μ g/mL 庆大霉素，65 μ g/mL青霉素，0.1 % PVA (w/v)，配制TL-HEPES-PVA所用试剂均购自Sigma公司。
[0058]卵母细胞成熟培养基:
[0059]基本培养基:TCM-199培养基，26.19mmol/L NaHCO3, 3.05mmol/L D-葡萄糖，0.91mmol/L丙酮酸钠，75 μ g/mL青霉素钠盐，50 μ g/mL链霉素硫酸盐和0.1 % PVA (w/v)，以上试剂均购自Sigma公司。
[0060]0-22小时培养基:在基本培养基中加入0.5 μ g/mL黄体化激素(Luteinizinghormone, LH), 0.5 μ g/mL 卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone, FSH)，10ng/mL表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF),体积百分比10 %猪卵泡液(porcinefollicular fluid,PFF)和0.57mmol/L半胱氨酸。以上试剂除PFF外均购自Sigma公司，PFF从猪卵泡液中分离，分离方法为:抽取卵泡液加入离心管中，离心取上清即为PFF。0-22小时培养基要提前一天配，配完后放在CO2培养箱中平衡过夜。
[0061]22-44小时培养基:不含FSH，LH和半胱氨酸，其它成分与0_22小时培养基相同。22-44小时培养基要提前配好后放在CO2培养箱中平衡过夜。
[0062]胚胎操作液:TCM-199，0.60mM NaHC03,0.l%HEPES,30mM NaCl，0.3%牛血清白蛋白(BSA) ,60 μ g/mL链霉素,50 μ g/mL青霉素，以上试剂均购自Sigma公司。
[0063]7.5 μ g/mL的细胞松弛素B (CCB)购买自Sigma公司。
[0064]卵丘细胞消化液:0.I %透明质酸酶。
[0065]融合/ 激活液:0.3mol/L 甘露醇，1.0mmol /T, CaCl2.2Η20,0.1 mmol/L MgCl2.6Η20,
0.5mmol/L HEPES,调PH值至7.4，以上试剂均购自Sigma公司。
[0066]PZM-5 (Porcine zygote medium5)胚胎培养液:108mmol/L NaCl, 10mmol/L KCl，
0.35mmol/L KH2PO4,0.40mmol/L MgSO4.7H20, 25mmol/L NaHCO3, 2mmoI/L L-谷氨酰胺，
4.99mmol/L 亚牛横酸(Hypotaurine), 50 μ g/mL 庆大霉素，0.20mmol/L 丙丽酸纳，0.06g/10OmL (CH3CH0HC00) 2Ca.5Η20(乳酸钙)，2% BME 氨基酸，I % MEM 非必需氨基酸，0.3% BSA,以上试剂均购自Sigma公司。
[0067]2%甲醛:用PBS配，购自Sigma公司。
[0068]0.1 % Tritonx-100:用 PBS 配，购自 Sigma 公司。
[0069]2.5 μ g/mL DAP1:购自 Molecular Probes 公司。
[0070]TUNEL 洗液:0.1 % PVA,用 PBS 配，购自 Sigma 公司。
[0071]TUNEL固定液:4%多聚甲醛，PBS配制。[0072]Dnase 1:DNA酶I，购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0073]为了使本【技术领域】的技术人员能够更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例，进一步阐述本发明:
[0074]实施例1核供体细胞的制备
[0075]本实施例采用猪胎儿成纤维细胞作为供体细胞，该供体细胞的制备方法如下:
[0076]猪胎儿成纤维细胞系(PEF细胞)的建立
[0077]从妊娠32天的母猪的子宫中取出胎儿，用IOmL含双抗的DPBS缓冲液冲洗3遍；在超净工作台中用灭菌的眼科剪去除胎儿的头、四肢和内脏，DPBS缓冲液冲洗后转移到一个新的培养皿中；用另外一把灭菌的眼科剪将剩余部分剪碎后，将组织碎片转移到50mL离心管中。往上述离心管中加入5mL0.25%胰酶，用ImL枪吹混匀，37°C消化4h。消化后，将液体部分转移到15mL离心管中，2000rpm离心15分钟；弃上清，向离心管中加入5mL DPBS,吹打均匀，1600rpm离心5分钟，重复两次；弃上清，向离心管中加入5mL DMEM高糖培养基，吹打均匀，以ImL/皿均匀地加入到100_培养皿中，放入37°C培养箱中培养。
[0078]猪胎儿成纤维细胞传代培养:
[0079]当细胞生长到80%汇合时，弃去原来的培养液，加入3rnL DPBS缓冲液洗两遍，每个细胞培养板中加入ImL0.25%胰酶消化液，37°C消化3分钟，待细胞开始脱落或变圆时用手拍打培养皿使细胞完全脱落。加入2mL( —传三)含10% FBS的DMEM高糖培养基终止消化，并用辅助移液器吹打细胞使其分散均匀。将分散的细胞悬液以ImL/皿均匀地接种到新的细胞培养皿中，并补加2mL含10% FBS的DMEM高糖培养基，放在37°C，5% CO2培养箱中培养。
[0080]重编程因子基因重组载体转入供体细胞:
[0081]当上述猪胎儿成纤维细胞传代培养所得培养皿中细胞生长到80%汇合时，弃去原来的培养液，加入3mL DPBS洗两遍，每个细胞培养板中加入ImL0.25%胰酶消化液，37°C消化3分钟，待细胞开始脱落或变圆时用手拍打培养皿使细胞完全脱落。细胞脱落后加2mL含10% FBS的DMEM高糖培养基终止消化，吹打均匀后把细胞悬液转移到离心管中，1600rpm离心5min ;弃掉上清，加入ImL胚胎操作液，吹打均匀，放在超净工作台上，室温平衡Ih后，1600rpm离心5min，离心后倒掉上清，加入lmL4度预冷的孵育液重悬。所得细胞重悬液用细胞计数仪测细胞浓度后稀释至lxl06/mL，待用。
[0082]取所得浓度为IxlOfVmL的细胞重悬液18.6 μ L与1.4yL浓度为714ng/yL的PLv-CMV-ZsGreen-h0ct4质粒混合，使质粒终浓度为50ng/ μ L ;冰上孵育5min，取孵育过的细胞重悬液5 μ L加入38.5°C预热的15 μ L的胚胎操作液液滴中，即得核供体细胞。
[0083]采用荧光检测方法检测所得核供体细胞，以转染eGFP基因的PEF细胞作为对照组，鉴定结果为图2，其中核供体细胞绿色荧光为PLV-CMV-ZSGreen-h0ct4质粒中绿色荧光蛋白表达产生的，说明了本实施例制得的核供体细胞内部有重编程因子重组载体表达，即表达绿色荧光蛋白，所得核供体细胞即刻用于核移植。
[0084]实施例2猪克隆胚胎的制备
[0085]卵母细胞的采集和体外成熟培养
[0086]从屠宰场采集猪的卵巢，放在盛有0.9%生理盐水的保温瓶中(保温瓶温度维持在30~35°C )，此之内运回实验室；用37°C生理盐水清洗卵巢3~4次以除去血；用11号手术刀片将卵巢表层卵泡划开，使卵泡液流出，并用TL-HEPES-PVA洗卵液冲洗卵巢，收集卵泡液和冲洗液。取4mL的卵泡液在体式显微镜下挑选细胞质均一并有多层卵丘细胞(最少三层)的卵母细胞-卵丘细胞复合体(COCs)洗所得COCs两次，然后用基本培养基洗三次；之后转移到0-22小时培养基中，在38.5°C,5% C02条件下培养22小时；转移到22-44小时培养基中继续培养。培养42-44小时后，在含有lmg/mL透明质酸酶的胚胎操作液中反复吹打COCs以除去卵丘细胞，挑选排出第一极体、透明带完整、卵周隙清晰、胞质均匀的M II卵母细胞为受体。
[0087]核供体细胞核移植
[0088]实验设置:为了考察本发明提供的制备方法所获得的猪克隆胚胎的质量，实验安排实验组、空白对照组和阳性对照组，实验组为实施例1制备获得的核供体细胞；空白对照组为没有转入重编程因子的核供体细胞，即正常的供体细胞；阳性对照组为孤雌激活组。各个组别所采用的供体细胞见表1。三个组别所选用的卵母细胞均为按照上述M II卵母细胞的制备方法制备获得的M II卵母细胞，核移植过程操作一致。
[0089]表1不同组别所对应的核供体细胞
[0090]
【权利要求】
1.一种猪克隆胚胎的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤1:获得供体细胞； 步骤2:取重编程因子重组载体，转入所述供体细胞，得核供体细胞；将所述核供体细胞移植到去除细胞核的卵细胞中，融合和激活，即得。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述转入具体为: 取所述重编程因子重组载体与所述供体细胞混合，于_4°C~4°C条件下孵育5min~IOmin0
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述混合所得的混合液中所述重编程因子重组载体的浓度为20ng/ μ L~80ng/ μ L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述孵育的时间为5min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述移植具体为: 取所述核供体细胞，用显微注射针注入所述去除细胞核的卵细胞。
6.根据权利要求1至5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤I所述供体细胞包括猪胎儿成纤维细胞、成体猪耳缘成纤维细胞或颗粒细胞。
7.根据权利要求1至5任意一项所述的制备方法，其特征在于，步骤2重编程因子包括0ct4、Klf4、c-Myc、Sox 2、Lin28或Nanog中的一种或者两者以上混合物。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤2所述重编程因子为0ct4。
【文档编号】C12N15/877GK103773805SQ201410029726
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2014年1月17日 优先权日:2014年1月17日
【发明者】冀倩倩, 赵海静, 宋振威, 赵广银, 丛佩清, 陈瑶生 申请人:中山大学