一株重组大肠杆菌及其在制备抗o157:h7的n-糖蛋白疫苗中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株重组大肠杆菌，命名为重组大肠杆菌CBEB，是将构建的重组质粒p-pglB-malEM和p-rfb共转化大肠杆菌CLM24中获得，其基因型是W3110?Δwaal/p-pglB-malEM+p-rfb。利用本发明所述重组大肠杆菌发酵制备抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗，生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗的大规模生产；且本发明方法生产的抗O157:H7?N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，为抗细菌感染的免疫治疗提供了新的选择，提示具有良好的工业开发和应用前景。
【专利说明】一株重组大肠杆菌及其在制备抗0157: H7的N-糖蛋白疫苗中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株重组大肠杆菌及构建方法以及该重组菌株在生产抗大肠杆菌0157:H7N-糖蛋白疫苗中的应用。属于生物技术、基因工程和微生物发酵领域。
【背景技术】
[0002]肠出血性大肠杆菌0157:H7在临床感染中常常引起血样腹泻、贫血和肾衰竭，常常危及患者生命。我国已分离出大肠杆菌0157: H7，表明我国也有该病爆发流行的潜在危险性，应引起足够重视。我国已将肠出血性大肠杆菌列为21世纪可能对国人卫生健康有重大影响的12种病原微生物之一，仅次于艾滋病病毒(HIV),排列第二。由于米用抗生素疗法能够导致大肠杆菌0157:H7的细胞壁溶解，促进细胞毒素的释放，从而加重病程。目前在临床中针对大肠杆菌0157:H7感染的治疗以预防和保守疗法为主。
[0003]糖蛋白疫苗被认为是最有效和最安全的抗病原菌疫苗之一，具有广阔应用前景。糖蛋白疫苗通过将细菌多糖如O抗原或荚膜多糖连接到具有免疫原性的载体蛋白上，此糖蛋白能引发依赖于T细胞的免疫应答，可以给予儿童以抵抗细菌感染并且也可以给成年人提供长时间持续的免疫应答。
[0004]目前，合成糖蛋白疫苗的方法主要是化学法。即通过基因工程技术表达和纯化载体蛋白，然后同提纯的病原菌表面多糖进行化学耦联。但是由于糖链化学激活的随机性，交联产生的糖蛋白具有高度不均一性；同时，此方法还存在着步骤繁杂、操作困难等问题。基于此，急待建立和开发新的可以大幅降低生产成本的糖蛋白疫苗生产方法。
【发明内容】
[0005]针对现有方法的不足，本发明要解决的问题是提供一株重组大肠杆菌及其在制备抗0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。
[0006]本发明的技术方案基于空肠弯曲菌N-连接糖基化途径同大肠杆菌脂多糖合成途径相似的特点，采用在大肠杆菌中表达来源于大肠杆菌中的rfb基因簇(0157:H7rfb基因簇:G1: 3435170)，并过量表达来源于大肠杆菌中的malE基因(来源NEB公司的质粒pMAL-p5X)突变体和来源于空肠弯曲菌的pglB基因(PglB NCBI_GeneID:905417)，在改良TB培养基中发酵生产抗0157:H7的N-糖蛋白。
[0007]本发明所述的重组大肠杆菌命名为重组大肠杆菌CBEB，其特征在于:所述重组大肠杆菌由如下方法制得:构建含malEM和pglB基因的共表达载体p-pglB-malEM,再构建含rfb基因簇的表达载体p-rfb,然后将上述构建的重组质粒p-pglB_malEM和p-rfb共转化大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达pglB、malEM基因和rfb基因簇的重组大肠杆菌CBEB，其基因型是 W3110 Δ waal/p-pglB-malEM+p-rfb ；
[0008]其中，所述malEM来源于质粒pMAL_p5X，所述pglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTCl 1168，共表达malEM和pglB基因的载体为pBAD24 ;所述rfb基因簇来源于大肠杆菌0157:H7 ;表达rfb基因簇的载体为pYESIL ；
[0009]上述malEM为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不的表达糖基化序列的基因所得；
[0010]上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌W3110的waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Araal，命名为大肠杆菌CLM24。
[0011 ] 上述重组大肠杆菌CBEB的构建方法概述:
[0012]l.waal基因的敲除
[0013]基本方法是通过Red重组系统在大肠杆菌E.coli W3110中敲除基因waal (寡糖基转移酶)。所得缺失waal基因的大肠杆菌E.coli W3110 AraaI命名为CLM24。
[0014]上述Red重组系统，是通过质粒pSM19表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Εχο，通过设计带有同源臂的引物扩增带有筛选标记的kan (卡那霉素抗性基因)的重组片段。然后通过电穿孔仪电击，将重组片段转入表达λ噬菌体重组酶Gam、Bet和Exo的大肠杆菌中，重组片段在重组酶的作用下与基因组上的目的基因发生重组，从而将原有的基因置换下来，而抗性基因通过表达FLP内切酶，从基因组上切除掉。
[0015]2.rfb基因簇的表达载体的构建
[0016]基本方法是以大肠杆菌0157:H7基因组为模板，克隆rfb基因簇，将所获得的rfb基因簇插入到线性质粒PYESlL中，从而获得rfb基因簇的表达载体p-rfb。
[0017]3.malEM和pglB基因的共表`达载体的构建
[0018]基本方法是以空肠弯曲菌基因组为模板，克隆pglB基因，将所克隆获得的pglB插入质粒PBAD24中，从而获得pglB的表达载体p-pglB ；以质粒pMAL_p5X为模板，克隆malEM基因，将所克隆获得的malEM插入质粒p-pglB中，从而获得malEM和pglB的共表达载体p-pglB_malEM0
[0019]4.N-糖蛋白发酵重组菌株的构建
[0020]基本方法是将所构建的重组质粒p-pglB和p-pglB_malEM共转化大肠杆菌CLM24中，从而获得表达rfb基因簇，过量表达malEM和pglB的重组大肠杆菌CBEB。
[0021 ] 本发明所述重组大肠杆菌在制备抗大肠杆菌0157: H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。
[0022]进一步的，具体的制备抗大肠杆菌0157:H7的N-糖蛋白疫苗方法是:
[0023]1.摇瓶培养
[0024]挑取所构建的重组菌株CBEB单菌落至装有3-5mL的改良TB培养基的25mL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100 μ g/mL，壮观霉素终浓度为50μ g/mL，37°C，200-225r/min，培养12h。
[0025]将过夜培养的菌液按照0.5-3% (v/v)的接种量接入装有50mL改良TB培养基的IOOmL的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100 μ g/mL，壮观霉素终浓度为50 μ g/mL，37°C，200-225r/min。
[0026]待菌液OD6qq=0.4-0.6时，按照0.5-3% (v/v)的接种量接入装有IL改良TB培养基的3L的三角瓶中，氨苄青霉素终浓度为100 μ g/mL，壮观霉素终浓度为50 μ g/mL，37°C，200-225r/min。
[0027]待菌液OD6qq=0.6-0.8时，加入终浓度为0.2 % (v/v)的L-阿拉伯糖，16-37°C,200-225r/min。[0028]上述加入L-阿拉伯糖后，发酵温度优选28°C。
[0029]待4_6h后，补加一次终浓度为0.2% (v/v)的L-阿拉伯糖，16-37°C，200_225r/min，继续培养14-16小时。
[0030]上述优选6h再次加入L-阿拉伯糖，发酵温度优选28°C，继续培养14h。
[0031]2.N-糖蛋白纯化
[0032]将摇瓶发酵的菌液10，000-12，000r/min离心5-10min。离心所得沉淀用lmg/ml溶菌酶4°C处理lh。10，000-12，000r/min离心5_10min，用亲和镍柱纯化，收集N-糖蛋白的洗脱液，超滤脱盐。
[0033]其中，摇瓶发酵中N-糖蛋白的产量为3mg/L。
[0034]本发明公开的重组大肠杆菌及其在制备抗0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用具有非常重要的应用价值。
[0035]利用本发明提供的重组大肠杆菌发酵制备抗0157:H7N-糖蛋白疫苗，生产步骤简单，生产周期短，产量高，生产成本低，可以应用于抗0157:H7N-糖蛋白疫苗的大规模生产；同时，本发明方法生产的抗0157:H7N-糖蛋白疫苗具有良好的免疫效果，为抗细菌感染的免疫治疗提供了新的选择， 提示具有良好的工业开发和应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1.糖蛋白疫苗一步发酵生产方法原理示意图。
[0037]图2.基因敲除原理步骤示意图及waal基因敲除琼脂糖凝胶电泳检测。
[0038]图3.p-rfb表达载体图谱。
[0039]图4.p-pglB-malEM表达载体图谱。
[0040]图5.SDS-PAGE分析MBP糖基化。MBP为malEM基因表达的蛋白，MBP-PS为糖基化的 MBP。
[0041]图6.Western blot分析MBP糖基化。泳道I为MBP，泳道2为MBP-PS。
[0042]图7.MALD1-T0F 分析 MBP 糖基化。
[0043]图8.小鼠血清抗0157的IgG抗体ELISA检测。
[0044]图9.小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4的ELISA检测。
【具体实施方式】
[0045]—般性说明:如下实施例所涉及的酶均购自Thermo公司，质粒提取试剂盒和琼脂糖凝胶回收DNA片段试剂盒购自天根公司，操作完全按照相应说明书进行。质粒构建中基因测序由华大基因公司完成。质粒pYESIL来源于invitrogen公司；质粒pBAD24和出发菌大肠杆菌W3110来源于ATCC(美国典型菌种保藏中心)；DH5a感受态细胞购自全式金生物技术有限公司。4-6周龄Balb/C雌性小鼠，购于山东大学新药评定中心。细胞因子测定ELISA试剂盒购自深圳达可为有限公司。实施例中的其他实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0046]所述LB培养基为:蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaC110g/L。
[0047]所述SOC 培养基为:蛋白胨 2g/L，酵母粉 0.5g/L，NaCl0.0585g/L, KC10.0186g/L,MgCl20.203g/L, MgSO40.246g/L，葡萄糖 20mmol/L。[0048]所述改良TB培养基为:蛋白胨10_20g/L，酵母粉5_30g/L，甘油1-lOml/L，NaC15-10g/L。
[0049]实施例1、大肠杆菌W3110waal基因的敲除
[0050](I)同源片段的克隆
[0051]利用Red重组系统对目的基因进行敲除。根据Genbank公布的waal基因序列设计引物:
[0052]pKD-waal F:
[0053]5，-TTGGAAAAGTTATCATCATTATAAAGGTAAAACATGCTAACATCCTTTAAACTTCATTCATTGAAACCTTACACTCTGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’
[0054]pKD-waal R:
[0055]5，-GAGTTTTAACTCACTTCTTAAACTTGTTTATTCTTAATTAATTGTATTGTTACGATTATTAATGACGAGTAAGAGGACATGGGAATTAGCCATGGTCC-3，
[0056]以PKD4通过PCR (聚合酶链式反应)体外扩增获得带有卡那霉素抗性的重组片段。PCR反应体系如下:(引物浓度为20 μ mol/L)
[0057]
【权利要求】
1.一株重组大肠杆菌，该菌命名为重组大肠杆菌CBEB，其特征在于:所述重组大肠杆菌由如下方法制得:构建含malEM和pglB基因的共表达载体p-pglB-malEM,再构建含rfb基因簇的表达载体p-rfb,然后将上述构建的重组质粒p-pglB-malEM和ρ-rfb共转化大肠杆菌CLM24中，得到能同时表达pglB、malEM基因和rfb基因簇的重组大肠杆菌CBEB，其基因型是 W3110 Δ waal/p-pglB-malEM+p-rfb ； 其中，所述malEM来源于质粒pMAL-p5X，所述pglB基因来源于空肠弯曲杆菌NCTCl 1168，共表达malEM和pglB基因的载体为pBAD24 ;所述rfb基因簇来源于大肠杆菌0157:H7 ;表达rfb基因簇的载体为pYESIL ; 上述malEM为malE基因突变体，是通过在malE基因的3’末端插入一段核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不的表达糖基化序列的基因所得； 上述大肠杆菌CLM24是通过敲除出发菌株大肠杆菌W3110的waal基因而构建的大肠杆菌工程菌，其基因型为W3110Araal，命名为大肠杆菌CLM24。
2.权利要求1所 述重组大肠杆菌在制备抗大肠杆菌0157:H7的N-糖蛋白疫苗中的应用。
【文档编号】C12N1/21GK103740632SQ201410029563
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】陈敏, 马中瑞, 张化杰, 商文静, 王鹏 申请人:山东大学