红锥ssr4标记、引物对及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种红锥SSR4标记、引物对及其制备方法和应用，发明人利用特定引物对HZ4对红锥总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列SSR4标记。该法简单易行、操作简便，得到的简单重复序列在两个红锥天然群体的居群内和居群间检测表明具有较高的多态性。红锥SSR4标记是共显性标记，较之其它分子标记，SSR标记重复性好、可靠性高，可应用于红锥的遗传多样性评价、红锥遗传图谱构建、红锥种群遗传变异空间分布格局和红锥起源进化的研究，以及目标基因的标定，还可应用于红锥的分子标记辅助育种和QTL研究。
【专利说明】红锥SSR4标记、引物对及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物科学中的分子标记【技术领域】，尤其涉及一种红锥SSR4标记、引物对及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]红维(Castanopsishystrix)为壳斗科(Fagaceae)栲属(Castanopsis)常绿乔木，是华南地区重要的乡土阔叶、优质珍贵用材树种。它生长快、适应广、效益高，可用做建筑、造船、高档家具等；萌芽力强，枝叶浓密，较耐荫蔽，混生性能好，可纯林种植，亦可混交造林，是针叶树种混交造林的最理想的伴生树种之一；红锥对生境适应能力强，在群落中位于乔木层，为优势种，对于维持群落稳定具有重要作用，特别适宜人工营造用材林和水源涵养林。由于红锥木材非常珍贵，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了严重破坏。
[0003]SSR标记(Simple sequence repeat),也叫微卫星序列重复,是由一类由几个核苷酸为重复单位组成的长达几十乃至数百个核苷酸的重复序列，长度较短，广泛分布在染色体上。由于重复单位的次数的不同或重复程度的不完全相同，造成了 SSR长度的高度变异性，由此产生SSR标记。虽然SSR在基因组上的位置不尽相同，但是其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以用微卫星区域特定顺序设计成对引物，通过PCR技术，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，即可显示SSR位点在不同个体间的多态性。SSR标记具有以下优点:(I)标记数量丰富，具有较多的等位变异，广泛分布于各条染色体上；(2)是共显性标记，呈孟德尔遗传；(3)技术重复性好，易 于操作，结果可靠。
[0004]尽管国内外的学者已经使用ISSR、RAPD等多种标记研究了红锥群体的遗传多样性，红锥群体的遗传结构和不同种源红锥间的遗传关系和距离，但是ISSR和RAro两种标记均为显性标记，稳定性差，且不能直接应用于分子标记辅助育种和QTL定位。因此，研究红锥SSR标记、开发红锥的SSR引物很有必要。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种红锥SSR4标记、引物对及其制备方法和应用。
[0006]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:红锥SSR标记，具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，微卫星标记编号为SSR4。
[0007]扩增上述红锥SSR标记的引物对HZ4，包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
[0008]上述红锥SSR标记的制备方法，利用特定引物对HZ4对红锥总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；引物对HZ4包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的碱基序列。
[0009]上述红锥SSR标记的制备方法，包括以下步骤:
[0010]<1>红锥总DNA提取与酶切
[0011]选取红锥幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min灭活内切酶；反应体系20 μ L，包括2.0 μ L的lOXBuffer，1.0 μ L的EcoRV内切酶,2 μ L的DNA，15.0 μ L的灭菌双蒸水；
[0012]〈2>接头的连接
[0013]将步骤〈DEcoRV酶切的红锥基因组DNA连接上下接头；60 μ L连接体系中含有酶切的红锥基因组DNA9yL，上下接头各IOOpmol ;连接反应在I倍T4连接酶缓冲条件下进行，于16°C连接过夜；连接后的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶；
[0014]〈3>连接产物的扩增
[0015]过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1.5%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化；
[0016]<4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段
[0017]将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上，然后转化到感受态细胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取400-1000bp左右的片段；
[0018]〈5>测序、引物设计与扩增分析
[0019]将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primer5.0软件对测序结果进行SSR引物设计并送合成，得引物对HZ4 ;利用引物对HZ4在红锥基因组中扩增出片段SSR4标记。
[0020]步骤〈2>中上下接头分别具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的碱基序列；步骤〈3>中AP2和复合SSR引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的碱基序列；步骤<4>中M13引物对具有序列·表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的碱基序列；步骤<5>中引物对HZ4分别具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的碱基序列。
[0021]上述红锥SSR标记的制备方法，步骤〈5>中扩增按以下操作进行:
[0022]扩增体系:反应体系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25个单位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0023]扩增程序:95°C预变性 5min;95°C变性 30s，52°C 复性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30个循环；最后72°C延伸IOmin。
[0024]上述红锥SSR4标记在红锥的分子标记辅助育种方面的应用。
[0025]上述红锥SSR4标记在红锥的QTL (数量性状基因座)研究方面的应用。
[0026]经过对红锥的深入研究，发明人利用特定引物对HZ4对红锥总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列SSR4标记。具体制备方法包括以下步骤:〈1>红锥总DNA提取与酶切；<2>接头的连接；〈3>连接产物的扩增；〈4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段；〈5>测序、引物设计与扩增分析。该法简单易行、操作简便，得到的简单重复序列在两个红锥天然群体的居群内和居群间检测表明具有较高的多态性。红锥SSR4标记是共显性标记，较之其它分子标记，SSR标记重复性好、可靠性高，可应用于红锥的遗传多样性评价、红锥遗传图谱构建、红锥种群遗传变异空间分布格局和红锥起源进化的研究，以及目标基因的标定，还可应用于红锥的分子标记辅助育种和QTL研究。
【具体实施方式】
[0027]实施例[0028]<1>红锥总DNA提取与酶切
[0029]选取红锥幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min灭活内切酶；反应体系20yL，包括2.0yL的lOXBuffer，1.0 μ L的EcoRV内切酶,2 μ L的DNA，15.0 μ L的灭菌双蒸水；
[0030]〈2>接头的连接
[0031 ] 将步骤〈DEcoRV酶切的红锥基因组DNA连接上下接头(上接头序列GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT,序列表 SEQ.1D.N0.4 ;下接头序列ACCAGCCC-NH2，序列表SEQ.1D.N0.5);60μ L连接体系中含有酶切的红锥基因组DNA9u L，上下接头各IOOpmol ;连接反应在I倍T4连接酶缓冲条件下进行，于16°C连接过夜；连接后的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶；
[0032]〈3>连接产物的扩增
[0033]过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2 (序列表SEQ.1D.N0.6)和复合SSR引物(序列表SEQ.1D.N0.7)为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1.5%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化； [0034]<4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段
[0035]将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors (Takara)上，然后转化到感受态细胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物对(M13F和M13R，序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9)进行PCR扩增检测，选取400_1000bp左右的片段；
[0036]〈5>测序、引物设计与扩增分析
[0037]将步骤<4>PCR产物送至上海英骏生物技术有限公司测序；利用Primer5.0软件对测序结果进行SSR引物设计并送上海英骏生物公司合成，得引物对HZ4 (序列表SEQ.1D.N0.2和序列表SEQ.1D.N0.3);利用引物对HZ4在红锥基因组中扩增出片段SSR4标记(序列表 SEQ.1D.N0.l)o
[0038]扩增按以下操作进行:
[0039]扩增体系:反应体系1(^1^，包括30-50叩的模板0嫩，0.25个单位的0嫩聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)；
[0040]扩增程序:95°C预变性 5min;95°C变性 30s，52°C 复性 45s，72°C 延伸 lmin30s，30个循环；最后72°C延伸IOmin。
[0041]〈6>多态性分析
[0042]以30个来自2个不同种源的红锥基因组DNA为材料检测引物多态性；在30个红锥个体中扩增出4条谱带，说明HZ4为多态性引物。
【权利要求】
1.一种红锥SSR标记，其特征在于具有序列表SEQ.1D.N0.1的碱基序列，微卫星标记编号为SSR4。
2.扩增权利要求1所述红锥SSR标记的引物对HZ4，其特征在于包括具有序列表SEQ.1D.N0.2 和 SEQ.1D.N0.3 的碱基序列。
3.权利要求1所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于利用特定引物对HZ4对红锥总DNA进行PCR扩增，得到简单重复序列；所述引物对HZ4包括具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的喊基序列。
4.根据权利要求3所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于包括以下步骤: <1>红锥总DNA提取与酶切 选取红锥幼嫩的叶片，用CTAB法提取核基因组；用EcoRV在37°C下酶切3h，65°C下20min灭活内切酶；反应体系20 μ L，包括2.0 μ L的lOXBuffer, 1.0 μ L的EcoRV内切酶，2 μ L的DNA，15.0 μ L的灭菌双蒸水； 〈2>接头的连接 将步骤〈DEcoRV酶切的红锥基因组DNA连接上下接头；60 μ L连接体系中含有酶切的红锥基因组DNA9 μ L，上 下接头各IOOpmol ;连接反应在I倍Τ4连接酶缓冲条件下进行，于16°C连接过夜；连接后的混合物在65°C反应20min，灭活连接酶； <3>连接产物的扩增 过夜步骤〈2>连接后的混合物以AP2和复合SSR引物为上下引物对连接后的混合物进行PCR扩增；1.5%的琼脂胶电泳，切胶回收500-1000bp的片段，试剂盒纯化； <4>克隆并筛选富集的微卫星DNA片段 将步骤<3>PCR产物连接到载体pMD18-T Vectors上，然后转化到感受态细胞E.coil中，涂布到含有Amp的平板培养基上，37°C培养过夜；用M13引物进行PCR扩增检测，选取400-1000bp左右的片段； <5>测序、引物设计与扩增分析 将步骤<4>PCR产物送测序；利用Primerf.0软件对测序结果进行SSR引物设计并送合成，得引物对HZ4 ;利用引物对HZ4在红锥基因组中扩增出片段SSR4标记。
5.权利要求4所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于: 步骤〈2>中上下接头分别具有序列表SEQ.1D.N0.4和SEQ.1D.N0.5的碱基序列； 步骤<3>中AP2和复合SSR引物分别具有序列表SEQ.1D.N0.6和SEQ.1D.N0.7的碱基序列； 步骤<4>中M13引物对具有序列表SEQ.1D.N0.8和SEQ.1D.N0.9的碱基序列； 步骤<5>中引物对HZ4分别具有序列表SEQ.1D.N0.2和SEQ.1D.N0.3的碱基序列。
6.权利要求5所述红锥SSR标记的制备方法，其特征在于步骤〈5>中扩增按以下操作进行:扩增体系:反应体系10 μ L，包括30-50ng的模板DNA，0.25个单位的DNA聚合酶(TaKaRa)，1.Ομ L 的 lOXBuffer，2.5mM MgCl2I μ I, 2.5mM dNTPsl μ I, 0.1 μ I bovineserum albumin (BSA)； 扩增程序:95°C预变性5min;95°C变性30s, 52°C复性45s, 72°C延伸lmin30s, 30个循环;最后72°C延伸IOrnin0
7.权利要求1所述红锥SSR4标记在红锥的分子标记辅助育种方面的应用。
8. 权利要求1所述红锥SSR4标记在红锥的QTL研究方面的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103740704SQ201410029390
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】蒋燚, 刘海龙, 朱积余, 黄荣林, 姜英, 何应会 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院