快速鉴定红锥的pcr检测方法及其引物对的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速鉴定红锥的PCR检测方法及其引物对，发明人开发了一对红锥鉴定引物cc1和cc2。采用该引物对对红锥总DNA进行PCR扩增,电泳检查扩增结果，若得到阳性扩增，则供试品为红锥，否则不是红锥。由于聚合酶链反应技术成熟，所以该法具有较高的准确性；而且整个检测便捷、快速，实验时间不超过6个小时。因此，应用本发明能够实现高效、准确地鉴别红锥。
【专利说明】快速鉴定红锥的PCR检测方法及其引物对
【技术领域】
[0001]本发明属于林业科学中分子标记鉴定【技术领域】，尤其涉及一种快速鉴定红锥的PCR检测方法及其引物对。
【背景技术】
[0002]红维(Castanopsishystrix)为壳斗科(Fagaceae)栲属(Castanopsis)常绿乔木，是华南地区重要的乡土阔叶、优质珍贵用材树种。它生长快、适应广、效益高，可用做建筑、造船、高档家具等；萌芽力强，枝叶浓密，较耐荫蔽，混生性能好，可纯林种植，亦可混交造林，是针叶树种混交造林的最理想的伴生树种之一；红锥对生境适应能力强，在群落中位于乔木层，为优势种，对于维持群落稳定具有重要作用，特别适宜人工营造用材林和水源涵养林。由于红锥木材非常珍贵，近些年遭到了大量采伐，其天然林遭受了严重破坏。
[0003]红维与其近缘种白椎(Castanopsiscarlesii Hayata)、越南白椎(Castanopsistonkinensis)之间很难从形态上区分开来。为有效开发利用该树种，防止在选育、繁育和利用时与近缘种发生混淆，迫切需要一种快速鉴定红锥的检测方法。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是提供一种高效、准确的快速鉴定红锥的PCR检测方法及其引物对。
[0005]为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:快速鉴定红锥的PCR检测方法的引物对，包括引物ccl和引物cc2，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的
碱基序列。
[0006]快速鉴 定红锥的PCR检测方法，采用引物ccl和引物cc2对红锥总DNA进行PCR扩增，电泳检查扩增结果；若用鉴定引物得到阳性扩增，则供试品为红锥。
[0007]上述快速鉴定红锥的PCR检测方法，包括以下步骤:
[0008]<1>提取红锥总DNA
[0009]摘取健康、干净的叶片I~10片(要求叶片无病斑、无枯萎现象，幼嫩叶片效果更佳)，用液氮处理叶片后进行研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒进行总DNA的提取获得基因组DNA模板，稀释为50~80ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存备用；
[0010]<2>PCR 扩增
[0011]反应体系:25yL体系中含约 60ng 模板 DNA，1.25U Taq 酶，1.5mmol.L1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0012]扩增条件:94°C预变性5min ;94°C变性 lmin，52°C复性 45s，72°C延伸 2min，35 ~39个循环；最后72°C延伸5min ；
[0013]<3>电泳检查
[0014]PCR产物在含有GelRed的2%琼脂糖凝胶中电泳，以IOObp Marker作为标准分子量对照，紫外自动成像仪照相。[0015]判断标准:若该样品为红锥，则可得到长度为340bp的扩增条带；若样品不是红锥，则检测不到扩增条带。
[0016]针对目前缺乏红锥快速有效鉴定方法的问题，发明人开发了一对红锥鉴定引物ccl和cc2。采用该引物对对红锥总DNA进行PCR扩增，电泳检查扩增结果，若得到阳性扩增，则供试品为红锥，否则不是红锥。由于聚合酶链反应技术成熟，所以该法具有较高的准确性；而且整个检测便捷、快速，实验时间不超过6个小时。因此，应用本发明能够实现高效、准确地鉴别红锥。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1是实施例1电泳检查结果图。
[0018]图2是实施例2电泳检查结果图。
[0019]图3是实施例3电泳检查结果图。
【具体实施方式】
[0020]以下实施例所用鉴定引物cc I (5’ -gacagacagacagacagttc-3’)和 cc2(5’-gacaga cagacagacaactg-3’)采用全自动DNA合成仪合成而得。引物为白色粉末结晶，采用纯净水将引物溶解至终浓度IOOymol.L—1，震荡混匀后，放置于冰箱-20°C保存备用。
[0021]实施例1
[0022]< I >提取样品总DNA
[0023]摘取健康、干净的叶片I片(疑似红锥样品，来源于广西林科院树木园)，用液氮处理叶片后进行研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生物)进行总DNA的提取获得纯度符合要求的基因组DNA模板，稀释为50ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存备用；
[0024]<2>PCR 扩增
[0025]反应体系:25μ L 体系中含约 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0026]扩增条件:94°C预变性5min ;94°C变性 lmin，52°C复性 45s，72°C延伸 2min，35 个循环；最后72°C延伸5min;
[0027]<3>电泳检查
[0028]PCR产物在含有GelRed的2%琼脂糖凝胶中电泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作为标准分子量对照，EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相(见图1)。
[0029]结论:扩增出一条电泳条带,大小介于400bp~500bp之间,表明该样品是红锥。
[0030]实施例2
[0031 ] 〈 I >提取样品总DNA
[0032]摘取健康、干净的叶片5片(疑似红锥样品，来源广西林科院树木园)，用液氮处理叶片后进行研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生物)进行总DNA的提取获得纯度符合要求的基因组DNA模板，稀释为65ng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存备用；
[0033]<2>PCR 扩增
[0034]反应体系:25μ L 体系中含约 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.25mmol.L MNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0035]扩增条件:94°C预变性5min ;94°C变性 lmin，52°C复性 45s，72°C延伸 2min，37 个循环；最后72°C延伸5min;
[0036]<3>电泳检查
[0037]PCR产物在含有GelRed的2%琼脂糖凝胶中电泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作为标准分子量对照，EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相(见图2)。
[0038]结论:没有扩增出电泳条带，则该样品不为红锥。从叶片形态上观察，叶片较红锥叶片稍偏大，有可能为白椎。
[0039]实施例3
[0040]< I >提取样品总DNA
[0041]摘取健康、干净的叶片10片(疑似红锥样品，采集于海南尖峰岭自然保护区)，用液氮处理叶片后进行研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒(天根生物)进行总DNA的提取获得纯度符合要求的基因组DNA模板，稀释为SOng/μ L，放置于冰箱_20°C保存备用；
[0042]<2>PCR 扩增
[0043]反应体系:25μ L 体系中含约 60ng 模板 DNA, 1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。
[0044]扩增条件:94°C预变性5min ;94°C变性 lmin，52°C复性 45s，72°C延伸 2min，39 个循环；最后72°C延伸5min;`
[0045]<3>电泳检查
[0046]PCR产物在含有GelRed的2%琼脂糖凝胶中电泳，以IOObp Marker (GeneRulerlOOladder, Fermentas UAB, Inc.)作为标准分子量对照，EPSON (Japan)紫外自动成像仪照相(见图3)。
[0047]结论:没有扩增出电泳条带，则该样品不为红锥。从叶片形态上观察，叶片较红锥叶片明显偏大，有可能为越南白椎。
【权利要求】
1.一种快速鉴定红锥的PCR检测方法的引物对，其特征在于包括引物CCI和引物CC2，它们分别具有序列表SEQ.1D.N0.1和SEQ.1D.N0.2的喊基序列。
2.一种快速鉴定红锥的PCR检测方法，其特征在于采用引物ccl和引物cc2对红锥总DNA进行PCR扩增，电泳检查扩增结果。
3.根据权利要求1所述的快速鉴定红锥的PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤: <1>提取红锥总DNA 摘取健康、干净的叶片I~10片，用液氮处理叶片后进行研磨，采用植物基因组DNA提取试剂盒进行总DNA的提取获得基因组DNA模板，稀释为50~SOng/ μ L，放置于冰箱_20°C保存备用； <2>PCR扩增 反应体系:25 μ L 体系中含 60ng 模板 DNA，1.25U Taq 酶，1.5mmol.T1MgCl2,`0.2 Smmol.L 1ClNTPs,引物 ccl 和引物 cc2 各 0.15 μ mo I.L1。 扩增条件:94°C预变性5min ;94°C变性lmin，52°C复性45s，72°C延伸2min，35~39个循环；最后72°C延伸5min ； <3>电泳检查 PCR产物在含有GelRed的2%琼脂糖凝胶中电泳，以IOObp Marker作为标准分子量对照，紫外自动成像仪照相。
【文档编号】C12Q1/68GK103757119SQ201410029308
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】刘海龙, 蔡玲, 朱积余, 韦颖文, 黄金使, 覃玉凤, 曾永明 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院