水稻衰老控制基因OsCDC48E及其编码的蛋白质的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻衰老相关控制基因OsCDC48E序列，及其编码翻译的蛋白质和氨基酸序列。本发明通过图位克隆技术从水稻早衰突变体W95中克隆得到一个控制水稻叶片衰老的基因OsCDC48E，通过功能互补实验验证OsCDC48E是控制水稻生长发育、叶片衰老相关的基因。通过透射电镜观察,光合速率以及光反应和暗反应检测技术的分析，证明了本发明克隆的早衰基因对于水稻的生长发育，叶绿体中类囊体的完整性和内质网细胞器结构等均具有明显的调节作用。利用基因工程技术可以把衰老基因的一些特异标记性状应用于水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。
【专利说明】水稻衰老控制基因及其编码的蛋白质
【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种利用图位克隆技术克隆的水稻0sCDC48E基因，以及可利用该基因来调控水稻叶片衰老相关途径和植物生长发育过程中细胞分裂的调控机制，以此来进行水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。本发明的衰老控制基因还可作为基因转化植株后代的追踪标记和杂交制种过程中真杂种的指示标记。
【背景技术】
[0002]水稻是世界上重要的粮食作物，稻米的总产量占世界粮食作物产量第三位，仅低于玉米和小麦，但它加工简单，食用方便，可以维持较多人口的生活。全球约有35亿人，有一半的人口食用稻米，主要分布在亚洲、欧洲南部和热带美洲及非洲部分地区，就我国而言就有60%以上的人口以稻米为主食。
[0003]植物的衰老是植物生长发育过程中最后阶段，是一种细胞有序降解死亡的过程，而细胞程序性死亡则是由很多相关因子一起作用的结果，其中包括植物本身基因的调控和外界环境的影响。植物本身基因如衰老相关基因SAG的调控，叶绿体和线粒体等其他细胞器相关基因的突变，还有一些氧化还原酶或过氧化氢酶调控基因的变异，均可导致衰老的产生。而外界环境可能是由于干旱的胁迫，高盐或者是高温等外界环境，还有一些病虫害的影响等都可以直接或者是间接的引起植物衰老。目前植物衰老的主要内容包括:(I)植物在生理生化途径中发生的一系列直接或者是间接的衰退过程；(2)在细胞组织器官中，植物本身经过长期进化和自 然选择，最终导致衰老；(3)最主要也是最直接的导致植物体产生衰老的机制，是由于受到一些衰老相关基因(SAG)的控制，出现衰老相关基因上调或抑制衰老基因的下调。
[0004]植物的衰老一般最开始，也是最显著的变化是发生在叶片叶绿体中的，同时也导致线粒体、细胞核和其他细胞器出现衰老，致使植物寿命减短，严重影响植物尤其是水稻、小麦和玉米等谷物的产量。水稻作为模式植物，是世界上最重要的粮食作物之一，其基因组学研究一直走在其他作物的前列。同时水稻T-DNA插入获得的突变群体、水稻全长cDNA完全测序、基因芯片的发展和多基因转化体系的建立等方面也取得了重要进展，克隆和鉴定了多个重要的水稻功能基因。因此，利用水稻功能基因组研究的知识，开展水稻叶片衰老相关基因的克隆和功能分析，可以为培育水稻超高产新品种提供强大的技术支撑。
[0005]目前只有少数的水稻衰老基因被鉴定，仍有大量的植物衰老相关的基因有待鉴定。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种新的水稻衰老基因，具有调控水稻细胞分裂控制植株衰老的功能，可以利用该基因来调控水稻叶片衰老相关途径和植物生长发育过程中细胞分裂的调控机制，以此来进行水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。
[0007]本发明的第一方面，提供一种分离的水稻0sCDC48E编码的蛋白质。[0008]一种水稻衰老控制基因0sCDC48E编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有控制水稻衰老的功能。
[0009]进一步地，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
[0010]优选地，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]在本发明的第二方面，提供一种分离的编码上述蛋白质的多核苷酸。
[0012]所述基因的核苷酸序列与SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
[0013]所述基因的核苷酸序列包括在SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
[0014]优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0015]本发明还提供了含有上述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。
[0016]所述植物表达载体为pCAMBIA1300-0sCDC48E。
[0017]所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。宿主细胞含有上述载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。
[0018]本发明通过图位克隆技术从水稻早衰突变体W95中克隆控制水稻衰老基因?5似6￥泌，功能互补实验证明《5似6￥泌是控制水稻衰老相关基因。通过透射电镜和光合速率，以及光反应和暗反应检测技术的观察，证明了本发明克隆的早衰基因对于水稻的生长发育，叶绿体中类囊体的完整性等均具有明显的调节作用。利用基因工程技术可以把衰老基因的一些特异标记性状应用于水稻品种改良、产量增加和培育超级稻。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为水稻早衰突变体表型；其中，I一分蘖期野生型IR64 ;2 —分蘖期突变体W95 ;3—抽穗期野生型IR64 ;4—抽穗期突变体W95。
[0020]图2为0sCDC48E基因在水稻第3染色体上的精细定位。
[0021]图3-a、图 3-b 为表达载体 pCAMBIA1300_0sCDC48E 图谱。
[0022]图4为功能互补实验TO代转基因水稻的表型示意图；其中，I一IR64 ;2—W95 ;3—W95-0sCDC48E。
【具体实施方式】
[0023]以下结合附图和实施例对本发明做进一步的说明。
[0024]实施例1:突变体的分离与遗传分析
通过对EMS诱变的水稻(IR64)突变体库的筛选，分离获得了一个水稻早衰突变体W95，其表型能稳定遗传，在分蘖期开始出现早衰表型如图1所示1、2)，到抽穗期早衰表型十分明显(如图1所示3、4)。利用突变体W95与Moroberekan杂交获得F1，F1植株具有正常的叶片表型和生育期，F2代中的野生型和突变体表型的分离比符合孟德尔单隐性突变的分离比，说明突变体W95的早衰表型由单隐性基因控制。
[0025]实施例2:突变基因的精细定位
根据已公布的粳稻和籼稻的分子遗传图谱，选取近似均匀分布于各染色体上的SSR引物进行多态性检测及初步定位分析，将突变体W95与Moroberekan杂交获得的F2群体中具有突变体表型的单株作为定位群体，共鉴定3429株具有突变体表型的F2个体，其中的1192株作为初定位群体。初定位结果表明该突变基因位于第3染色体短臂RM14394和RM14408之间。
[0026]筛选获得RM14394和RM14408之间在亲本间有多态性的引物RM6829、HQN195、HQN32、RM14395和HQN141，并用这7对引物分析2237个F2群体中的突变个体，利用获得的信息构建物理图谱。最终将突变基因精细定位于第3染色体BAC克隆0SJNBa0038D20上RM14395和HQN141标记之间17.6kb范围内(如图2所示)。
[0027]实施例3:基因预测和序列比对分析
根据上述结果，对该区间3个预测基因进行测序分析。发现编码cell divisioncontrol protein 48 homolog E蛋白的基因与野生型相比，突变体W95中该基因⑶S核苷酸系列的第2347位由C变成了 T，导致该核苷酸编码的蛋白质提前终止，使得该蛋白的功能受到影响，因此将该基因定为候选基因并命名为0sCDC48E。
[0028]实施例4 ,0sCDC48E基因功能互补验证 构建包含《5似6￥泌基因全长编码区(SEQ ID N0.1)及自身启动子的互补载体pCAMBIA1300-0sCDC48E (图3_a,图3_b)，转化到农杆菌EHA105,以农杆菌介导法转化突变体W95。转基因植株表现为正常叶片表型和生育期，通过测序发现其在突变位点呈双峰，实验结果表明互补载体能够完全恢复W95的早衰突变表型(图4)。如图3-a和3_b所示的pCAMBIA1300-0s⑶C48E，该载体可以表达有上述核苷酸序列编码的多肽或其同源类似物。
[0029]以上所述仅为本发明的若干个【具体实施方式】，应当指出，对于本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种水稻衰老控制基因《5似6￥泌编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列与SEQID N0.2所示的氨基酸序列具有至少90%的同源性，所述蛋白质具有控制水稻衰老的功能。
2.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述的蛋白质氨基酸序列为SEQIDN0.2所示的氨基酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个氨基酸而生成的具有相同功能的氨基酸序列或衍生物。
3.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示。
4.编码权利要求1所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列与SEQIDN0.1所示的核苷酸序列具有至少90%的同源性。
5.编码权利要求2所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列包括在SEQID N0.1所示的核苷酸序列中添加、取代、插入或缺失一个或多个核苷酸而生成的突变体、等位基因或衍生物的核苷酸序列。
6.编码权利要求3所述蛋白质的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
7.一种含有权利要求4-6任一权利要求所述基因序列的质粒或植物表达载体或宿主细胞。
8.根据权利要求7所述的植物表达载体，其特征在于，所述植物表达载体为pCAMBIA1300-0sCDC48E。
9.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
【文档编号】C12N1/21GK103788189SQ201410031292
【公开日】2014年5月14日 申请日期:2014年1月22日 优先权日:2014年1月22日
【发明者】吴建利, 黄奇娜, 施勇烽, 王惠梅, 宋莉欣 申请人:中国水稻研究所