克隆表达优化的非洲猪瘟vp72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法
【专利摘要】本发明提供了一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法，该核酸疫苗由序列表中SEQ?ID?NO.3非洲猪瘟病毒的VP72基因和真核表达载体pcDNA3.3组成。动物实验结果表明所构建的核酸疫苗可以有效地刺激宿主的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应。
【专利说明】克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及兽医生物技术和基因工程【技术领域】，特别是涉及一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法。
【背景技术】
[0002]非洲猪瘟是猪的一种烈性病毒病，自1909年首次在非洲发现以来，目前已蔓延扩散到整个非洲、欧洲和南美洲等国家和地区，发病国家因此蒙受了巨大的经济损失，该病被国际动物卫生组织(OIE)列为重要动物疫病。我国虽然还没有发现非洲猪瘟疫情，但根据周边国家的发病情况，以及2006年以来我国部分省市暴发的猪流行性疫病给我们敲响了警钟，我国已面临ASFV传入和流行的严重威胁。目前，国内外学者对其疫苗研制开展了大量工作，但还无有效的疫苗和药物可以预防和治疗该病。研究发现，非洲猪瘟灭活疫苗效果不明显，而弱毒疫苗的安全性差，易导致慢性流行，迫切需要一种新型疫苗来克服目前存在的问题。
[0003]核酸疫苗与传统的灭活疫苗、亚单位疫苗和基因工程疫苗等相比，其具有如下优点:1免疫保护力增强，主要是通过接种后蛋白质在宿主细胞内表达，直接与组织相容性复合物MHC I或II类分子结合，同时诱导产生细胞免疫和体液免疫；2制备简单，省时省力。核酸疫苗作为一种重组质粒，易在工程菌内大量扩增，提纯方法简单，且可将编码不同抗原基因的多种重组质粒联合应用，制备多价核酸疫苗，这样可大大减少人力、物力、财力以及多次接种带来的应激反应；3同种异株交叉保护是核酸疫苗的最大优点之一，可通过对基因表达载体所携带的靶基因进行改造，从而选择抗原决定簇；4核酸疫苗应用较安全，接种后蛋白质抗原在宿主细胞内表达，不存在毒力返祖或残留毒力病毒引起发病的危险，也不会引起对机体的不良反应；5可产生持久免疫应答，一次接种可获得长期免疫力，无需反复多次加强免疫；6贮存、运输方便，核酸疫苗的质粒DNA稳定性好，便于贮存和运输，无须冷藏。因此，核酸疫苗可能是解决非洲猪瘟免疫防控的有力工具。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题在于，针对当前国内外无非洲猪瘟有效疫苗防控的问题，提供一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列、基因、核酸疫苗及构建方法。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案是，提供一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列，其特征在于，该引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述，其中SEQ ID N0.1为非洲猪瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ ID N0.2为非洲猪瘟病毒VP72基因下游引物。
[0006]本发明还提供一 种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因，包括序列表中SEQ IDN0.3的基因序列。
[0007]本发明还提供一种非洲猪瘟核酸疫苗，该疫苗由序列表中SEQ ID N0.3的非洲猪瘟VP72基因和真核表达载体组成。
[0008]在本发明所述的非洲猪瘟核酸疫苗中，所述的真核表达载体可为任何一种DNA疫苗载体。
[0009]在本发明所述的非洲猪瘟核酸疫苗中，所述的真核表达载体为pcDNA3.3。
[0010]本发明还提供一种非洲猪瘟核酸疫苗的构建方法，包括如下步骤:
[0011](I)合成ASFV VP72基因，并克隆至PUC18克隆载体中，标记为PUC18-ASFV VP72 ；
[0012](2)根据已经合成的ASFV VP72基因核酸序列，利用核酸引物设计软件设计特异性PCR引物，并在上游引物引入G/A NN序列，引物序列分别如序列表中SEQ ID N0.1和SEQID N0.2所示；并从pUC18-ASFV VP72质粒中扩增获得包括NN序列和ASFV VP72全基因的序列，大小为1944bp，如序列表中SEQ ID N0.3所示；
[0013](3)将步骤(1)中扩增获得的ASFV VP72基因经过凝胶电泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表达载体中，得到重组质粒pcDNA-ASFV-VP72 ；
[0014](4)用Puv I限制性内切酶将高度纯化的pcDNA-ASFV-VP72线性化后，利用脂质体将其转染到BHK-21细胞中，经过G418持续加压筛选、PCR检测鉴定后，获得阳性细胞系。
[0015]根据本发明构建的非洲猪瘟核酸疫苗，使得非洲猪瘟VP72基因在哺乳动物细胞中显著表达，并有效刺激被接种动物的免疫系统，使之产生较好的体液免疫反应和细胞免疫反应，有利于免疫抵抗非洲猪瘟 病毒。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1非洲猪瘟VP72基因的PCR扩增
[0017]图2 重组质粒 pcDNA-ASFV-VP72 的 PCR 鉴定
[0018]其中1:阴性对照；2、3:VP72弓丨物对扩增pcDNA-ASFV_VP72质粒的PCR结果；
[0019]4、5:载体上游引物和VP72下游引物扩增pcDNA-ASFV_VP72质粒的PCR结果；
[0020]6:VP72 基因阳性对照；M:DL6000DNA Marker。
[0021]图3重组质粒pcDNA-ASFV-VP72转染BHK-21细胞后的PCR鉴定结果
[0022]其中1、4:正常细胞对照；2、3、5、6:转染细胞；7:阴性对照；8:pcDNA_VP72质粒对照；M:DL2000DNA Marker。
[0023]图4重组质粒pcDNA-ASFV-VP72转染BHK-21细胞后的间接免疫荧光试验结果。
[0024]图4A为pcDNA-ASFV-VP72重组质粒转染BHK-21细胞后表达蛋白的免疫荧光试验结果。
[0025]图4B为pcDNA-lacZ质粒转染BHK-21细胞后表达蛋白的免疫荧光试验结果。
[0026]图5Balb/C小鼠血清中VP72抗体0D450值变化趋势图，其中A组为pcDNA_VP72核酸疫苗免疫组组为pcDNA-lacZ载体对照组；C组为PBS对照组。
[0027]图6新西兰兔血清中VP72抗体0D450值变化趋势图，其中A组为pcDNA_VP72核酸疫苗免疫组组为pcDNA-lacZ载体对照组；C组为PBS对照组。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0029]实施例1:非洲猪瘟病毒VP72基因的PCR扩增与序列分析
[0030]根据Genebank上发布的非洲猪痕病毒VP72的基因序列，利用PrimerPrimer5.0引物设计软件设计一对PCR引物，可扩增VP72基因的完整序列，并在上游引物的5’端引进(G/A) NN序列，引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2:
[0031]SEQ ID N0.1Pl: 5’ -AATATGGCATCAGGAGGAGCTT-3’
[0032]SEQ ID N0.2P2:5，-TTAGGTACTGTAACGCAGCACAG-3’
[0033]以pUC18-ASFV VP72质粒为模板，利用引物对P1/P2进行扩增，反应体系为50 μ L:10XBuffer5y L,25mM dNTP Mixl μ L, 25mM MgCl22 μ L,上下游引物各 I μ L，Taq 酶 0.2μ L，质粒模板5 μ L，用灭菌的双蒸水补充至50 μ L0
[0034]反应程序为:94°CImin ；94°C lmin，56°C lmin，72°C 2min，30 个循环；72°C lOmin,4 °C 2h。
[0035]经1.2%琼脂糖凝胶上电泳检测PCR扩增产物，结果发现一条特异性扩增条带，大小约为1.9kb，说明设计的引物可特异性的扩增VP72基因。
[0036]实施例2:非洲猪瘟病毒VP72基因核酸疫苗的构建
[0037]PCR扩增ASF V的VP72基因，分别亚克隆到pCDNA3.3(+)真核表达载体上，构建了 VP72基因的重组真核表达载体。将以上构建的真核表达载体转染BHK-21细胞进行瞬时表达，结果在转染48h后VP72蛋白的得到了表达，间接免疫荧光为阳性，而空质粒P⑶NA3.3(+)和未转染质粒组的BHK-21细胞均呈阴性反应。体外转染实验表明含VP72基因真核表达载体能在体外获得表达，从而为下一步的动物试验提供了如提条件。
[0038]2.1凝胶回收
[0039]PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，用凝胶回收试剂盒(TaKaRa MiniBestAgarose Gel DNA Extraction Kit Ver3.0,大连宝生物公司)回收纯化约1944bp的目的扩增片段，具体操作步骤如下:
[0040]将电泳后的琼脂糖凝胶置于紫外检测仪下，切下含目的片段的凝胶，分析天平称胶块的质量，按Img = I μ L计算胶块的体积。加入4倍体积的GM Buffer,在15°C -25°C融化lOmin，待胶块完全融化。将离心吸附柱安置在收集管上，转移融化后的混合液至吸附柱中，静置2min，12000rpm，离心lmin。将离心后的滤液转移至吸附柱中，12000rpm，离心Imin,以提高DNA的回收效率。弃滤液，加入700 μ L的WB洗液，12000rpm,离心30sec，弃滤液，重复洗涤一次。空柱，12000rpm离心lmin，然后将吸附柱安置在灭菌的Ep管上，加入30 μ L 的 Elution Buffer,室温静置 lmin, 12000rpm 离心 lmin,洗脱 DNA。洗脱后的 DNA 可直接用于连接转化或者保存在_20°C冰箱。
[0041 ] 2.2连接构建核酸疫苗
[0042]采用TOPO克隆反应体系，室温反应将目的基因连接到pcDNA3.3载体中，构建重组表达载体PCDNA-ASFV-VP72，即本文中提及的核酸疫苗。TOPO克隆反应体系为:PCR凝胶回收产物4 μ L，Salt Solutionl μ L，pcDNA3.3T0P0载体I μ L，室温放置5min后转冰浴。克隆产物可直接用于转化，或者保存在_20°C冰箱。
[0043]转化前先在室温预热S.0.C.培养基，并在37°C预热含氨苄青霉素(0.lg/L)的LB平板。采用化学法将TOPO克隆产物转到TOPlO感受态大肠杆菌中。转化步骤如下:[0044]I)将2 μ L TOPO克隆反应液加到1份Τ0Ρ10感受态大肠杆菌中，轻轻拍动管壁数次，充分混匀，切忌吹打。
[0045]2)冰上放置30min，在42°C热激30s后迅速置于冰上，勿振摇。
[0046]3)加入250 μ L S.0.C.培养基，盖上盖子后于37°C 200rpm水平振荡培养lh。
[0047]4)取10-50 μ L菌液涂布在含氨苄青霉素的抗性LB平板上，将涂布后的含氨苄青霉素的LB平板，于37 °C过夜培养。 [0048]2.3筛选阳性克隆
[0049]随机挑取单菌落10个以上，分别接种于ImL含0.lg/L氨苄青霉素的LB培养基中，250rpm，37°C振荡培养4~5h。待菌液出现云雾状沉淀时，分别用VP72基因的引物对、VP72基因的上游引物和载体下游引物，取菌液作PCR鉴定。
[0050]PCR 反应体系为 25μ L:10XBuffer2.5μ L，25mM dNTP Mix0.5 μ L,25mMMgCl2l.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L, Taq酶0.5 μ L，菌液模板0.5 μ L，用灭菌的双蒸水补充至25 μ L0
[0051]反应程序:940C 2min ；94 °C 30sec，56 °C 30sec，72 °C 1.5min，30 个循环；72°C 10min,4°C 2h。
[0052]PCR反应结束后，用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测，若出现两条特异性扩增条带，大小分别为1944bp和2098bp，说明目的基因已经正向插入到pcDNA3.3中。
[0053]对于正向插入的菌液样品可扩大培养，取10 μ L菌液接种到50mL含0.lg/L氨节青霉素的LB培养基中，250rpm，37°C振荡培养过夜。
[0054]2.4小量制备重组质粒核酸疫苗
[0055]利用质粒小量提取试剂盒(PureLinkHiPure Plasmid DNA MidiprepPurification Kit, Invitrogen公司)对过夜培养的菌液提取质粒DNA,质粒提取步骤如下:
[0056]I)平衡:在HiPure Midi吸附柱中加入IOmL平衡缓冲液，室温静置，让缓冲液在重力作用下自然过柱。
[0057]2)菌液收集:将2.3中过夜培养的菌液取20mL在无菌操作台中加入到50mL的离心管中，常温下4000 Xg,离心10min,弃上清,收集细菌。
[0058]3)重悬菌体:加入4mL重悬缓冲液于细菌沉淀中，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于缓冲液中。
[0059]4)裂解:加入4mL裂解缓冲液到上述菌体重悬液中，温和颠倒五次，室温静置5min。
[0060]5)沉淀:加入4mL沉淀缓冲液到上述混合液中，立即颠倒数次，直至混匀，室温12000 Xg,离心 IOmin0
[0061]6)结合:将上清液加入到平衡后的吸附柱中，让上清液在重力作用下自然过柱。
[0062]7)洗涤:加入IOmL的洗涤缓冲液到吸附柱中，重力作用下过柱，弃洗液。用该洗涤缓冲液重复洗涤一次。
[0063]8)洗脱:在吸附柱下放置新的灭菌15mL离心管，向吸附柱中加入5mL洗脱液，重力作用下过柱，收集洗脱液。
[0064]9)沉淀和洗涤:向洗脱液中加入3.5mL的异丙醇，混匀，4°C 12000 X g，离心30min，弃上清。加入3mL70%的乙醇重悬沉淀，4°C 12000 X g,离心5min,弃上清。
[0065]10)重悬:沉淀自然干燥IOmin后，加入200 μ L的TE缓冲液重悬，将所制备的质粒DNA保存于_20°C。
[0066]实施例3:重组质粒pcDNA-ASFV-VP72的鉴定
[0067]3.1 重组质粒 pcDNA-ASFV-VP72 的 PCR 鉴定
[0068]对上述提取的质粒用灭菌水稀释100倍后，用PCR进行鉴定。
[0069]PCR 反应体系为 25μ L:10XBuffer2.5μ L，25mM dNTP Mix0.5 μ L,25mMMgCl2l.5 μ L，上下游引物各0.5 μ L, Taq酶0.5 μ L，菌液模板0.5 μ L，用灭菌的双蒸水补充至25 μ L0
[0070]反应程序:940C 2min ；94 °C 30sec，56 °C 30sec，72 °C 1.5min，30 个循环；72°C 10min,4°C 2h。
[0071]PCR反应结束后，用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测观察结果。
[0072]3.2重组质粒pcDNA-ASFV-VP72中目的基因的测序鉴定
[0073]对筛选鉴定为VP72正向插入的pcDNA3.3-ASFV-VP72质粒送大连宝生物有限公司进行测序鉴定，测序结果采用Clustal X软件进行DNA及氨基酸同源性分析，确定插入的VP72基因序列正确、无突变。
[0074]将测序正确的pcDNA3.3_ASFV_VP72质粒标记后于_20°C保存，并将相应的阳性菌液也同时保存，保存方法是加终浓度20%左右的灭菌甘油保存于_80°C。
[0075]实施例4:脂质体介导转染BHK-21细胞
[0076]4.1重组质粒pcDNA-ASFV-VP72的线性化
[0077]采用PvuI内切酶对重组质粒和空质粒进行线性化。酶切体系为:10XKBuffer20y L,0.1%BSA20 μ L, PvuI 内切酶 10μ L，质粒 DNA15y L (≤ 10 μ g)，用灭菌的双蒸水补充至200 μ L0将酶切反应液混匀后，37°C作用30min。
[0078]纯化:待酶切完毕后，在上述反应液中加入IOyL NaAc (pH5.2)和500yL无水乙醇，室温沉淀90min ；12000rpm离心15min,弃上清，加入2mL70%乙醇，室温作用2h ；12000rpm离心5min,弃上清，自然干燥后,加入20 μ L灭菌的双蒸水。线性化后的质粒直接用于转染或-20 V保存备用。
[0079]4.2 转染
[0080]采用Lipofectamine2000转染试剂盒进行转染，同时设空质粒对照组(pcDNA3.3)，具体操作如下:
[0081]I)取对数生长状态的BHK-21细胞，转染前一天按每孔8X IO6细胞接种于6孔细胞培养板中，培养液用无双抗的生长液，培养液总体积为每孔2mL。
[0082]2)准备以下反应管:A管:取一支无菌离心管加入10 μ L质粒(5 μ g)和300 μ L的Opt1-MEMI培养基。B管:取一支无菌离心管加入7.5μ L的lipofectamine2000到150μ L的Opt1-MEMI培养基中。C管:取一支无菌离心管加入10μ L的lipofectamine2000到150 μ L的Opt1-MEMI培养基中。将B管和C管轻轻混匀，室温下放置5min。
[0083]3)将A管平均分成两份，分别与B管和C管混合液混匀，室温放置20min后，将其加入细胞悬液中轻轻混匀，在37°C、5% 二氧化碳培养中培养48-72h。转染4_6h后更换含1%双抗的生长液。[0084]4)待细胞长满六孔板，转移到25cm2的细胞培养瓶培养后，开始加入G418 (遗传霉素)进行加压筛选，遗传霉素的终浓度为400 μ g/mL，去除未转入PCDNA-ASFV-VP72的正常细胞。
[0085]实施例5:重组质粒pcDNA-ASFV-VP72在BHK-21细胞中的表达
[0086]5.1G418加压筛选、PCR检测鉴定
[0087]用G418连续加压筛选三代后，收集细胞转移入灭菌的1.5mL离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。加入少量的无血清培养基重悬细胞，然后取100 μ L的细胞悬液用磁珠快速提取系统进行核酸抽提，用于PCR检测，PCR检测方法同3.1。
[0088]5.2间接免疫荧光试验鉴定
[0089]采用间接免疫荧光试验检测ΒΗΚ-21细胞中表达的VP72蛋白，同时设pcDNA_lacZ阴性质粒对照，具体步骤如下:
[0090]I)将转染后72h的细胞接种24孔细胞培养板，待细胞铺满24孔板后，弃上清，PBS洗 3 次，500 μ L/ 孔，5min/次。
[0091]2)加入200 μ L_20°C预冷的丙酮:乙醇(6:4)固定液,室温固定IOmin后,弃固定液，自然挥干。此法制备的24孔板可立即使用或_20°C保存备用。
[0092]3)每孔加入200 μ L1: 100稀释的ASFV-VP72单克隆抗体，37°C湿盒内孵育lh，弃一抗，PBS 洗 3 次，5min/次。
[0093]4)每孔加入200 μ L1: 50稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，37°C避光作用30min，弃二抗，PBS 洗 3 次，5min/次。
[0094]5)每孔加入IOOyL含70%甘油的PBS，在倒置荧光显微镜下观察，拍片记录结果。
[0095]5.3SDS-PAGE、Western-blotting 鉴定
[0096]采用Western-blotting方法检测BHK-21细胞中表达的VP72蛋白，具体步骤如下:
[0097]I)弃去转染72h后的BHK-21细胞培养液，用预冷的PBS洗涤细胞2次。2)胰酶消化细胞，加入预冷的细胞培养液重悬细胞，40C，3000rpm离心3min，收集细胞。
[0098]3)加入ImL预冷的PBS轻轻洗漆细胞,2000rpm离心2min,弃上清,重复洗一次。
[0099]4)加入100 μ LI X SDS加样缓冲液重悬细胞，煮沸lOmin，12000rpm离心2min，取上清进行SDS-PAGE。
[0100]5)将处理好的样品加入12%的胶中进行电泳，20mA，30min，40mA，2h。
[0101]6)转膜:将PAGE胶上的蛋白转移至NC膜上，15V，30min。
[0102]7)封闭:转膜后，将NC膜在转膜缓冲液内浸泡5min，转移到TBST洗液中浸泡3min，然后在1%BSA的TBST中，4°C过夜封闭。弃封闭液，用TBST洗膜3次，5min/次。
[0103]8)加一抗:将膜浸在1:100稀释的ASFV-VP72单克隆抗体中，37°C孵育lh。将膜取出，用TBST洗涤3次，5min/次。
[0104]9)加二抗:将膜浸在1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG中，37°C孵育lh。将膜取出，用TBST洗涤3 次，5min/次。
[0105]10)底物显色:将膜浸在DAB显色液中，室温显色5~30min。然后将膜取出，浸在双蒸水中，观察结果。结果如图4所示，A图为pcDNA-ASFV-VP72重组质粒转染BHK-21细胞后表达蛋白的免疫荧光试验结果，B图为pcDNA-lacZ质粒转染BHK-21细胞后表达蛋白的免疫荧光试验结果。试验结果表明，获得的阳性BHK-21细胞中表达了非洲猪瘟VP72蛋白，表明研制的非洲猪瘟核酸疫苗在哺乳动物细胞中可以持续产生目的蛋白。
[0106]实施例6:非洲猪痕核酸疫苗的大量制备及纯化
[0107]利用质粒大量提取试剂盒(PureLinkHiPure Plasmid DNA MaxiprepPurification Kit, Invitrogen公司)对过夜培养的菌液提取质粒DNA,质粒提取步骤如下:
[0108]I)平衡:在HiPure Maxi吸附柱中加入30mL平衡缓冲液，室温静置，让缓冲液在重力作用下自然过柱。
[0109]2)菌液收集:将2.3中过夜培养的菌液取200mL在无菌操作台中分次加入到50mL的离心管中，常温下4000 X g，离心10min，弃上清，收集细菌。
[0110]3)重悬菌体:加入IOmL重悬缓冲液于细菌沉淀中，反复振摇，直至看不到细菌团块，细菌全部重悬于缓冲液中。
[0111]4)裂解:加入IOmL裂解缓冲液到上述菌体重悬液中，温和颠倒五次，室温静置5min。
[0112]5)沉淀:加入IOmL沉淀缓冲液到上述混合液中，立即颠倒数次，直至混匀，室温12000 Xg,离心 IOmin0
[0113]6)结合:将上清液加入到平衡后的吸附柱中，让上清液在重力作用下自然过柱。 [0114]7)洗涤:加入60mL的洗涤缓冲液到吸附柱中，重力作用下过柱，弃洗液。用该洗涤缓冲液重复洗涤一次。
[0115]8)洗脱:在吸附柱下放置新的灭菌50mL离心管，向吸附柱中加入15mL洗脱液，重力作用下过柱，收集洗脱液。
[0116]9)沉淀和洗涤:向洗脱液中加入10.5mL的异丙醇，混匀，4°C 12000Xg，离心30min,弃上清。加入5mL70%的乙醇重悬沉淀,4°C 12000 X g,离心5min,弃上清。
[0117]10)重悬:沉淀自然干燥IOmin后，加入300 μ L的TE缓冲液重悬，该重悬液中即含有所制备的质粒DNA。
[0118]11)将质粒适当稀释后，用PCR进行鉴定。
[0119]12)用灭菌的PBS将质粒DNA稀释100倍后，用紫外分光光度计测定质粒的浓度，将质粒DNA稀释成200 μ g/ μ L，300 μ L/管分装，-20°c保存备用。
[0120]实施例7:非洲猪瘟核酸疫苗的免疫原性研究
[0121]7.1接种小鼠试验
[0122]实验动物分组:健康SPF级雌性BALB/c小鼠，6-8周龄，共18只，随机分为3组，每组6只。实验分组如下:A组为实验组；B组为pcDNA-LacZ阴性质粒对照组；C组为PBS对照组。
[0123]接种前处理:每次免疫前24h于每只小鼠双后肢股四头肌注射0.75%盐酸普鲁卡因20 μ I。注射时在针头上加套一小管使针头只外露2-3mm，以保证每只小鼠注射时针头刺入肌肉深度较一致。注射时需垂直进针，缓慢注入，针头原位保持5-lOsec。
[0124]免疫接种程序:
[0125]将已经测好浓度的pcDNA3.3 / VP72重组质粒和pcDNA3.3/lacZ质粒分别免疫接种小鼠，50μ1 /次，即IOOyg/只，间隔2周免疫，共3次:[0126]⑴A组(实验组):每只小鼠分别在第0、2、4周经双后肢股四头肌注射pcDNA3.3 / VP72 重组质粒，50 μ I / 次。
[0127]⑵B组(质粒载体对照组):每只小鼠分别在第0、2、4周经双后肢股四头肌注射pcDNA3.3/lacZ 质粒载体，50 μ I / 次。
[0128](3)C组(PBS对照组):每只小鼠分别在第0、2、4周经双后肢股四头肌注射无菌PBS，50μ I / 次。
[0129]收集血清:
[0130]分别于每次免疫前(即0、2、4周)断尾取血，末次免疫后2周采用摘眼球法取血，置室温自然凝固后，剥离血块，2000 r / 11^11离心101^11，分离血清，10(^1 /管分装，_20°C保
存备用。
[0131]用间接ELISA方法检测血清中ASFV-VP72蛋白抗体滴度的变化，评价pcDNA_VP72核酸疫苗在小鼠动物模型中诱导产生体液免疫的能力。结果如图5所示，pcDNA-VP72核酸疫苗组小鼠在第一次免疫后两周，就可在血清中检测到特异性的VP72抗体；第二次免疫后两周抗体水平显著升高，且随着免疫次数的增加抗体滴度也随之升高。而pcDNA-lacZ载体对照组和空白对照组小鼠的血清中未检测到特异性VP72抗体，结果证实pcDNA-VP72核酸疫苗免疫小鼠后可在小鼠体内产生特异性的抗体应答。
[0132]7.2接种兔试验
[0133]实验动物分组:健康新西兰兔，随机分为3组，每组3只。实验分组如下:A组为实验组；B组为pcDNA-LacZ阴性质粒对照组；C组为PBS对照组。
[0134]免疫接种程序:
[0135]将已经测好浓度的pcDNA3.3 / VP72重组质粒和pcDNA3.3/lacZ质粒分别免疫接种新西兰兔，100 μ I /次，即200 μ g/只，间隔2周免疫,共3次:
[0136]⑴A组(实验组):每只兔分别在第0、2、4周经腿部肌肉注射pcDNA3.3 / VP72重组质粒，100 μ I /次。
[0137](2) B组(质粒载体对照组):每只兔分别在第0、2、4周经腿部肌肉注射pcDNA3.3/IacZ质粒载体，100 μ I /次。
[0138]⑶C组(PBS对照组):每只兔分别在第O、2、4周经腿部肌肉注射无菌PBS，100 μ I / 次。
[0139]收集血清:
[0140]分别于每次免疫前(即0、2、4周)以及末次免疫后2周耳静脉采血，置室温自然凝固后，剥离血块，2000r / min离心10min，分离血清，100μ I /管分装，_20°C保存备用。
[0141]用间接ELISA方法检测血清中ASFV-VP72蛋白抗体滴度的变化，评价pcDNA_VP72核酸疫苗在新西兰兔动物模型中诱导产生体液免疫的能力。结果如图6所示，pcDNA-VP72核酸疫苗免疫组的新西兰兔在第一次免疫后两周，就可在血清中检测到特异性的VP72抗体；第二次免疫后两周抗体水平显著升高，且随着免疫次数的增加抗体滴度也随之升高。而pcDNA-lacZ载体对照组和空白对照组的兔血清中未检测到特异性VP72抗体，结果证实pcDNA-VP72核酸疫苗免疫兔后可在兔体内产生特异性的抗体应答。
[0142]实施例8:非洲猪瘟核酸疫苗接种动物后的ELISA检测
[0143]采用商品化试剂盒内包被有VP73蛋白的ELISA板，用于间接ELISA检测。[0144]I)加一抗:用抗体稀释液(0.1%BSA的PBST)将待检血清从1:5开始做倍比稀释，每孔加入100 μ L，每个样品做3个重复，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照，37°C孵育Ih，用PBST洗涤5次。
[0145]2)加二抗:每孔加入100 μ L1:5000用PBS稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37°C孵育lh，用PBST洗涤5次。
[0146]3)底物显色:每孔加入100 μ L已经配制好的TMB底物溶液，避光显色5~15min。
[0147]4)终止反应:每孔加入50 μ L终止液终止反应，酶标仪测定并记录各孔0D450值，计算每个样品的平均值。
[0148]5)结果判定:阴性对照孔OD45tl值记为N，阳性对照孔OD45tl值记为P，若Ρ/Ν≥2.1，且P — N > 0.2，即判定结果为阳性。
[0149]本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。
[0150]实施例中所涉及的试剂信息如下表:
[0151]
【权利要求】
1.一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因引物序列，其特征在于，该引物序列如序列表中的SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所述，其中SEQ ID N0.1为非洲猪瘟病毒VP72基因上游引物，SEQ ID N0.2为非洲猪瘟病毒VP72基因下游引物。
2.一种克隆表达优化的非洲猪瘟VP72基因，其特征在于，包括序列表中SEQ ID N0.3的基因序列。
3.一种非洲猪瘟核酸疫苗，其特征在于，该疫苗由序列表中SEQ ID N0.3的非洲猪瘟VP72基因和真核表达载体组成。
4.根据权利要求3所述的非洲猪瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表达载体可为任何一种DNA疫苗载体。
5.根据权利要求4所述的非洲猪瘟核酸疫苗，其特征在于，所述的真核表达载体为pcDNA3.3。
6.一种非洲猪瘟核酸疫苗的构建方法，包括如下步骤: (1)合成ASFVVP72基因，并克隆至pUC18克隆载体中，标记为pUC18-ASFV VP72 ； (2)根据已经合成的ASFVVP72基因核酸序列，利用核酸引物设计软件设计特异性PCR引物，并在上游引物引入G/A NN序列，引物序列分别如序列表中SEQ ID N0.1和SEQ IDN0.2所示；并从pUC18-ASFV VP72质粒中扩增获得包括NN序列和ASFV VP72全基因的序列，大小为1944bp，如序列表中SEQ ID N0.3所示； (3)将步骤(1)中扩增获得的ASFVVP72基因经过凝胶电泳、回收后，克隆到pcDNA3.3真核表达载体中，得到重组质粒pcDNA-ASFV-VP72 ； (4)用PuvI限制性内切酶将高度纯化的pcDNA-ASFV-VP72线性化后，利用脂质体将其转染到BHK-21细胞中，经过G418持续加压筛选、PCR检测鉴定后，获得阳性细胞系。
【文档编号】C12N15/40GK103952401SQ201410073118
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年2月28日 优先权日:2014年2月28日
【发明者】张彩虹, 吕建强, 杨俊兴, 曹琛福, 宗卉, 陶虹, 孙洁, 曾少灵, 叶奕优, 黄超华, 刘建利, 花群义 申请人:深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心