一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法。该方法包括九个步骤：(1)制备培养基；(2)制备发酵种子菌液；(3)扩大发酵的条件；(4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法；(5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法；(6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法；(7)高效液相色谱法纯度检测；(8)质谱法分子量定性分析；(9)得到制备出包含分子量为364和382两种分子结构的水溶性抗生素的结论。本发明所制备的水溶性抗生素纯度高，与苏云金芽胞杆菌的CrylA、Cry1B、Cry1C等晶体蛋白协同作用可以提高对农业害虫的生物杀虫效果；另外对大肠杆菌和引起小儿肺炎的金黄色葡萄球菌也有抑制效果。
【专利说明】一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物防治【技术领域】，特别涉及一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法，该方法制备的水溶性抗生素含有364和382两种分子量的分子结构。
【背景技术】
[0002]1994年Manker发现蜡状芽胞杆菌(Bacillus cereusM编号UW85的菌株能够生物合成抗生素，该抗生素水溶性极强，分子景为396,分子构成C13H28N6O8,分子结构如下:
【权利要求】
1.一种水溶性抗生素的分离纯化制备方法，其特征在于具体步骤为: (1)制备培养基 1.1斜面培养基:牛肉膏3-6g，蛋白胨5-15g，氯化钠3-7g，琼脂粉10_20g，pH7.0-7.2，定容至1L, 121°C灭菌30min备用； 1.2菌株HD-1种子培养基:酵母膏3-7g，蚕蛹蛋白膏5-15 g，氯化钠5_15 g，ρΗ7.0-7.2，定容至 1L，121°C 灭菌 30min 备用； 1.3初始发酵培养基:葡萄糖10-30g，蚕蛹蛋白膏10-30g, CaCL2 0.05-0.10g, K2HPO4l-2g, MgSO4 0.1-0.3g, MnSO4 0.05-0.lg, pH 7.0-7.2，定容至 1L, 121°C灭菌 30min 备用； 1.4扩大生产发酵培养基:蚕蛹蛋白膏7-1 lg，葡萄糖2-5g，氯化钠l-4g，MgSO4.7H200.2-0.4g, K2HPO4 0.2-0.4g, MnSO4 0.02-0.07g, pH7.5，定容至 1L, 121°C 灭菌 30min 备用； 1.5供试菌活化培养基:牛肉膏2-8g，蛋白胨5-15g，氯化钠2-8g，pH 7.0-7.2，定容至1L, 121°C灭菌 30min 备用； 1.6抑菌活性测定固体培养基:牛肉膏2-8 g，蛋白胨5-15 g，氯化钠5-20 g，琼脂粉10-20g，pH 7.0-7.2，定容至 1L，121°C 灭菌 30min 备用； (2)制备发酵种子菌液 首先，将保存于_20°C冰箱的甘油保藏菌种HD-1放到室温复苏，至完全解冻，将其接种到LB斜面培养基上，30°C过夜培养，取出后保存于4°C冰箱备用；然后，从保存好的HD-1斜面培养基上取0.5 cm X 1.0 cm大小的斜面培养物接种于300mL摇瓶中，内含有种子培养基IOOmL,置于 220r/min 摇床 30°C培养 10-20 h ； .2.1菌株HD-1发酵液的制备 将活化好的HD-1种子培养基以2%的接种量接种到灭过菌的初始发酵培养基中，培养基不超过容器体积的2/3，30°C摇瓶培养20-40 h，然后，5000-10000r/min离心5_15min、收集上清，4°C冰箱保存，此过程有抗生素生物合成； . 2.2初次抑菌活性检测 采用管碟法，以草生欧文氏杆菌为指示菌，检测浓缩10倍后的HD-1发酵液上清液的抑菌活性，空白培养基作对照，将甘油保存的草生欧文氏杆菌菌种接种到活化培养基中，30°C摇瓶培养10-15h，然后2%的接种量将菌液加入到冷却至45°C的抑菌活性测定固体培养基中，轻摇混匀，先在灭菌的玻璃培养皿内加注无菌固体培养基作为底层，冷却后摆放牛津环，再将混匀的加菌液的固体培养基轻轻加入到底层培养基上，双层培养基都要薄而均匀，静置冷却后，用灭过菌的镊子轻轻取下牛津环，在孔中加入待测液，液面和上层培养基面齐平，然后，在28°C恒温培养箱内培养10-15h，测其抑菌圈直径大小，抑菌直径为抑菌圈外径减去牛津环外径，在做抑菌试验时，将上清液95°C水浴15min后，用lmol/L的NaOH调至中性或偏碱性，验证抗生素的存在，由于ZwA的浓度与抑菌圈直径存在线性关系，因此，将以抑菌圈的直径来间接表示ZwA浓度； (3)扩大发酵的条件 .3.1发酵培养基:采用18L发酵罐培养，罐内装培养基不能超过体积的2/3，以5-15L为且； . 3.2发酵时间:将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，培养20-40h ；.3.3培养温度:将活化好的摇瓶种子培养基接种到扩大生产发酵培养基中，在200C -40°C恒温下培养； .3.4培养基初始pH:将已接种的扩大生产发酵培养基，用lmol/L的HCl或lmol/L的NaOH 调 pH 值 5.0-10.0 ； (4)抗生素ZwA的第一次纯化萃取法 取IOL发酵液分批次5000-10000r/min离心，5_20min，回收上清液，用lmol/L的HCl调至PH4.0，在50°C下真空浓缩，真空度-0.095—0.088Mpa,浓缩至200mL，加入IOOmL无水乙醇，轻轻摇匀，静置I小时后再次5000-10000r/min离心5_20min，取上清，上清液用等体积的石油醚萃取后，收集水相，至无醇味和石油醚味，加水补至原体积，即得ZwA粗提液，做抑囷试验验证ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱备用； (5)抗生素ZwA的第二次纯化大孔树脂法 根据ZwA的水溶性强、弱极性等特点，选用非极性大孔树脂LX-68M、LX-22、LX-762及LXA-8对ZwA进行初步纯化； . 5.1大孔树脂预处理:称取一定量的湿重树脂，使用前均做预处理，流程如下，首先，将称好的树脂装入玻璃层析柱中(60cmX2cm)，用2倍柱床体积的lmol/L的HCl溶液以ImL/min的流速对树脂层进行洗脱，并浸泡树脂4h，然后用去离子水以同样流速冲洗树脂，至流出水pH呈中性；然后用2倍柱床体积的lmol/L的NaOH溶液以lmL/min的流速对树脂层进行洗脱，并浸泡树脂4 h，用去离子水以同样流速冲洗树脂，至流出水pH呈中性；再用I倍柱床体积的乙醇浸泡树脂6h ;用2倍柱床体积的乙醇以lmL/min的流速通过树脂柱，再浸泡树脂4h ;再用去离子水以同样流速洗至无乙醇味为止； .5.2 ZwA的纯化:按树脂量与粗提液1:2(W/V)的比例，分别上样10mL，湿法装柱，室温静态吸附3h后，先用去离子水动态洗脱，洗脱体积初定4倍柱床体积，洗脱液为未吸附相，再用50%的乙醇洗脱4倍柱床体积，洗脱组分为A，再用无水乙醇洗脱4倍柱床体积，洗脱组分为B，洗脱时流速约0.5mL/min，分别收集洗脱液，减压浓缩后去离子水定容至IOmLJiA和B分别做抑囷试验验证ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱备用； (6)抗生素ZwA的第三次纯化硅胶层析法 称取100-140目硅胶150g，用无离子水浸泡3h，冲洗，抽干，再用浓盐酸洗涤以除去残留的杂质，然后用去离子水洗至中性，抽干，再用无水乙醇浸泡过夜，抽干，临用前120°C烘干至恒重，再用无离子水浸泡过夜即可装60cmX 2cm层析柱； .6.1装柱与ZwA的上样:采用湿法装柱，干法上柱；用无离子水将浸泡过夜的硅胶搅拌成匀浆，缓慢加入玻璃层析柱中，60cmX2cm层析柱，多余无离子水洗脱剂流出，上层加入4cm的石油醚，然后取5mL大孔树脂第二次纯化后的样品ZwA，加入适量干硅胶搅拌至干粉状，缓慢加入层析柱的上层石油醚液中，目的是使样品暂时与洗脱剂分开，避免洗脱剂夹带样品快速流下，装柱要确保层析柱均匀，实在、无气泡、无断层；柱床总高度约30-50cm ； .6.2 ZwA的纯化:洗脱剂为乙酸乙酯:甲醇=70:30(V:V)，洗脱速度为0.5mL/min，用部分收集器分段收集，每管10mL，以紫外吸收法在线监测ZwA样品的紫外吸收出现，以2%茚三酮比色法在565nm波长下检测ZwA样品的颜色出现，直到无ZwA样品的紫外吸收出现、无ZwA样品的颜色出现时，终止洗脱，共收集30管，根据颜色一致性合并为10管，对各管溶液做抑囷试验验证ZwA的存在，之后保存于4 C冰箱备用；.6.3 ZwA样品的冷冻干燥处理:使用冷冻干燥机对上述各管液体进行冷冻干燥处理，冷冻干燥至无水成为干粉，之后保存于4°C冰箱备用； .6.4茚三酮比色反应 .6.4.1配置pH6.7的磷酸盐缓冲溶液:分别称取磷酸二氢钾4.5350g和磷酸氢二钠.11.9380g于小烧杯中，用少量去离子水溶解后，移入500ml容量瓶中，再用去离子水定容至刻度，摇匀备用，取55.0ml磷酸二氢钾溶液与45.0ml磷酸氢二钠溶液混合摇匀，即得到PH6.7的磷酸盐缓冲溶液； . 6.4.2配置2%茚三酮显色液:分别称取2.0OOOg茚三酮和1.0OOOg氯化铬，加入乙二醇缓慢加热至完全溶解，转入100ml容量瓶中，再用磷酸盐缓冲溶液定容至刻度，摇匀，放置过夜，次日用，若有沉淀，过滤后使用； . 6.4.3显色反应:取各管洗脱液分别0.5mL, 2%茚三酮0.5mL,磷酸盐缓冲溶液lmL，于1OmL带刻度试管中，摇匀后沸水浴15min,冷却IOmin,用去离子水定容至IOmL,摇匀，稳定15min后测量，以洗脱剂作空白对照，用紫外分光光度计先进行全190-800nm波长扫描，确定其最大紫外吸收波长，然后测定各样品在最大吸收波长下的吸光度A，绘制洗脱曲线； (7)高效液相色谱法纯度检测: .7.1检测样品制备:分别取6.3的干粉样品，分别用I毫升无离子水溶解，备用； . 7.2高效液相色谱法检测:将7.1的10个组分别做HPLC检测，用面积归一法分析其纯度； 色谱条件:反相C18分析柱，流动相为水:甲醇=85:15(V/V)，紫外检测器，检测波长210nm,流度 0.5mL/min,进样量 10 μ L,柱温 35°C ； .7.3再次用抑菌活性法检测:采用管碟法，对7.1的10个组分进行抑菌活性检测，进一步确定纯化后ZwA的富集区段； (8)质谱法分子量定性: 质谱检测:称取0.01OOg，用质谱检测仪鉴定其分子量； 质谱检测条件:电喷雾离子源即ESI，毛细管电压为3.5kV，锥孔电压为150V，离子源温度为100°C，干燥气温度为300°C，脱溶剂气体流速500L/h，锥孔气体流速为50L/h，水作溶剂； (9)结论: 由(8)质谱分析图确定，所制得的水溶性抗生素中含有364和382两种分子量的分子结构； 所述分子量为364的水溶性抗生素的分子结构为:
【文档编号】C12R1/18GK103805645SQ201410082586
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2014年3月9日 优先权日:2014年3月9日
【发明者】郝再彬, 李霞, 严丽, 张 杰, 宋福平 申请人:桂林理工大学