一种基于lamp技术快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法
【专利摘要】本发明公开了一种快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法，可用于田间核盘菌对多菌灵抗性群体的动态监测及流行预警。本发明是以环介导恒温扩增技术(LAMP)为基础建立起来的一种快速检测核盘菌对多菌灵高抗菌株的分子技术。该检测方法通过在多菌灵高抗核盘菌菌株的β-微管蛋白上(包括198位氨基酸突变位点)设计2对LAMP特异性引物，进行LAMP扩增；根据反应产物颜色判定是否为多菌灵高抗核盘菌菌株；如果颜色为天蓝色(有扩增产物)为多菌灵高抗核盘菌菌株；如果颜色为紫色(无扩增产物)则为多菌灵敏感核盘菌菌株。本发明简便、快速、成本低，对菌核病抗性监测及合理用药具有重要的现实意义。
【专利说明】—种基于LAMP技术快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法
【技术领域】
[0001]本发明是基于环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermalamplification, LAMP)对多菌灵高抗核盘菌菌株的快速分子检测,可用于核盘菌对多菌灵抗性群体发展的动态监测与抗性风险评估，进行抗药性油菜菌核病的流行预警，为油菜菌核病的防治提供用药指导。
【背景技术】
[0002]环介导恒温扩增反应(LAMP)是2000年由日本学者Notomi等发明的一种新颖的恒温核酸体外扩增技术，广泛应用于动物、植物等疾病的基因诊断。该技术原理是:利用一套(4种)特异性引物，在一种高活性链置换DNA聚合酶的作用下引起自循环链置换反应，60~65 °C范围60min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物——白色的焦磷酸镁沉淀产生。羟基萘酚蓝(HNB)是一种金属离子指示剂，根据反应液中镁离子的变化而呈现出不同的颜色，阴性(没有扩增出产物)时为紫色，阳性(有产物扩增)时为天蓝色。LAMP方法的最大特点就是实现恒温扩增，不需要循环仪等昂贵的仪器；扩增反应极快，一般在I小时内完成；扩增产生的产物量大，通过肉眼即可判定结果，不需要繁琐的电泳过程；灵敏度高、特异性强；操作简便、快捷，极适于病原的快速诊断及检测。
[0003]油菜菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一种分布较广、破坏性较强的世界性病害。该病菌 寄主范围非常广泛，能侵染包括75科278属408种及42个变种或亚种植物，给农作物的产量和质量造成了严重的经济损失。多年来一直使用以多菌灵为主的苯并咪唑类杀菌剂防治油菜菌核病，据报道，油菜菌核病菌已对多菌灵产生抗性，且抗性菌株分布范围逐年扩大，抗性群体比例不断上升，最终导致了多菌灵田间防效下降。经过多年的研究，南京农业大学植物药理学和病害防控实验室发现核盘菌对多菌灵的抗药性菌株主要是由微管蛋白基因(SS1G_04652.3)第198或200位氨基酸密码子突变造成，第198位氨基酸密码子GAG(Glu) — GCG(Ala)的突变对多菌灵表现为高抗，第200位氨基酸密码子TTC(Phe) — TAC(Tyr)的突变对多菌灵表现为低抗。其中第198位突变类型占所有抗药性突变类型总量的90%以上，成为病原菌产生田间抗药性的主要原因。
[0004]病原菌在自然界的数量巨大，抗药性个体在群体中的比例达到3%时，即可引起抗药性病害流行，导致药剂防治失败。传统的检测方法需要分离培养病原菌，然后用含药培养基上培养，再根据药剂对菌丝生长的抑制作用鉴别抗药性。本发明在抗药性机制研究的基础上，基于LAMP技术快速、准确检测核盘菌对多菌灵的抗药性。该检测方法具有简单、快速、成本低，灵敏性高等特点，能显著提高检测效率，对菌核病的有效防治、抗药性流行预警具有重要的现实意义。然而，经检索目前国内外尚未有核盘菌对多菌灵抗性菌株的LAMP快速分子检测的相关报道。
【发明内容】
[0005]已报道的核盘菌对多菌灵抗性菌株的鉴定及检测方法存在费时、费力、成本高等缺点。针对这一缺点，根据核盘菌对多菌灵抗性菌株的基因型，通过实验条件优化，建立了一种快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法。该方法具有简便、快速、省时省力、灵敏度高等特点，对菌核病的合理用药、控制病害发生与流行、减少经济损失具有实用价值。
[0006]田间检测的多菌灵高抗核盘菌菌株的突变类型是由核盘菌微管蛋白基因编码的第198位氨基酸密码子突变造成的。本发明所述的快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的分子生物学方法，步骤是:
[0007](I)在多菌灵高抗核盘菌菌株的微管蛋白基因上(包括198位氨基酸的序列)设计I对外引物和I对内引物，利用该引物在恒温条件下，进行LAMP扩增；
[0008]①LAMP反应所用的外引物对:
【权利要求】
1.一种基于LAMP技术快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法，步骤是: (1)运用2对特异性引物对待鉴定菌株的基因组DNA进行LAMP恒温扩增，其中所述的2对特异性引物的碱基序列分别是: LAMP反应所用的外引物对:
F3: TCGCCAAAGGTTTCCGATAC
B3:ACCAGGGAAACGGAGACAG LAMP反应所用的内引物对(含人为引入错配碱基):
FIP:GGCGTCAGAGTTCTCGACCAACGTCGTCGAGCCATATAACG BIP CGTCAGAGTTCTCGACCAACGTCGTCGAGCCATATAACG (2)对上述LAMP扩增产物观察其颜色变化，并在3.0 %琼脂糖凝胶电泳上分离，观察扩增结果； (3)鉴定是否为多菌灵高抗核盘菌菌株:如果LAMP扩增产物显示天蓝色，这时电泳图谱应为梯状条带，判定为多菌灵高抗核盘菌菌株；如果扩增产物为紫色，这时电泳图谱无条带扩增，判定为多菌灵敏感核盘菌菌株。
2.根据权利要求1所述快速检测多菌灵高抗核盘菌菌株的方法，其特征在于:步骤(1)所述的LAMP反应体系及条件分别是: 反应体系(10 μ L):5对 DNA 聚合酶(8U/A)0.4 pLIOxThermoPol1.0 μ?MgCl2 (25mM)1.6 μ?^dNTP (IOmM)1.0 pLFIP (40 μΜ)0.4 pLBIP (40 μΜ)0.4 μ?F3 (10μΜ)0.2 μ?Β3 (10μΜ)0.2 μ?甜菜碱(8 Μ)1.2 uLHNB (2.5 mM)0.6 μΕ基因组DNA0.4 μL(IH2O (灭菌蒸馈水)2.6 pL 反应条件:
63°C 60min,80°C IOmin0
【文档编号】C12Q1/04GK103820563SQ201410089651
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月12日 优先权日:2014年3月12日
【发明者】周明国, 段亚冰, 葛常艳, 张晓柯 申请人:南京农业大学