一种赣州慢生根瘤菌及其用途
【专利摘要】本发明公开了一种赣州慢生根瘤菌及其用途。赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?ganzhouense?sp.nov.）RITF806于2014年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC?NO：M2014044。本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的赣州慢生根瘤菌（Bradyrhizobium?ganzhouense?sp.nov.），该类菌株能与黑木相思（Acacia?melanoxylon）、网脉相思（Acacia?aneura）和灰木相思（Acacia?implexa）等结瘤共生，具有强的抗逆性，在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
【专利说明】一种赣州慢生根瘤菌及其用途
【技术领域】:
[0001]本发明属于微生物领域，具体涉及一种赣州慢生根瘤菌及其用途。
【背景技术】:
[0002]大气中含有78%的氮气，动植物不能直接利用，自然界只有部分原核微生物具有直接利用大气中氮气的能力，将其还原成氨，这就是固氮作用。世界上的人口、资源、环境已成为当今全球性的问题，被称为“绿色革命”的生物固氮日益受到重视，尤其在林业上的应用。由于林业具有生产周期长，立地条件复杂等特点，使林业的施肥并不像农业那样的方便、有效。因此，生物固氮成为林木所需氮素的重要来源。
[0003]一些发达国家的林业生产中，相当程度上依赖生物固氮的贡献，重视固氮微生物资源的开发与利用。由于物价的上涨、保护环境意识的提高，生物制剂以其物美价廉、环保而独受青睐。世界上许多国家都把研究和开发微生物肥料及制品作为一项长远的计划。
[0004]相思树种(Acacia)是我国引种的重要速生树种，它不仅速生而且适应性广，耐干旱痔薄，速生丰产，能产生根瘤，有固氮作用，具有良好的改良土壤性能，从其引进试种到目前的规模化种植，已在林业产业和生态环境建设中发挥了重大作用。针对研究的进展和林业生产应用需要，选择合适的根瘤菌微生物肥料，减少化学肥料的施放，可实现经济效益及生态效能的双赢，并能带动林业技术进步。
[0005]菌种是微生物肥料生产应用的基础。目前限制我国微生物肥料行业发展的瓶颈是优良菌株的选育问题。林 业生产迫切需求固氮能力强、抗逆性强的微生物肥料生产用菌株。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是提供一种高效固氮结瘤的，能与黑木相思、网脉相思和灰木相思共生结瘤的新菌种一籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobium ganzhouense sp.nov.) RITF806,该菌于2014年2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2014044o
[0007]本发明还提供了籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)RITF806在制备固氮微生物菌剂和生物有机肥中的应用。
[0008]本发明是从黑木相思根瘤中分离筛选出的赣州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)，该类菌株能与黑木相思(Acacia melanoxylon)、网脉相思(Acaciaaneura)和灰木相思(Acacia implexa)等结瘤共生,具有强的抗逆性,在固氮微生物菌剂和生物有机肥生产中具有广阔的应用前景。
[0009]本发明的籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense)RITF806 于 2014 年 2月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2014044。
【专利附图】
【附图说明】:
[0010]图1是赣州慢生根瘤菌的16S rRNA与参比菌株的系统发育树[0011]图2是采用最大似然法构建的系统发育树，其是以赣州慢生根瘤菌和慢生根瘤菌属内较相近种群的持家基因recA(355nt)，glnll(497nt)和atpD(391nt)的序列拼接构建的。
[0012]图3是慢生根瘤菌属代表菌株极性酯的组成，1:赣州慢生根瘤菌RITF806菌株；4:Bradyrhizobium huanghuaihaiense CCBAU23303T 菌株
[0013]图4是黑木相思幼苗接种赣州慢生根瘤菌RITF806 ；
[0014]图5是赣州慢生根瘤菌RITF806的透射电镜照片。
【具体实施方式】:
[0015]以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0018]YMA 培养基:甘露醇 10.0g，谷氨酸钠 0.5g，K2HPO40.5g，MgSO4.7Η200.2g，NaCl0.01g，酵母粉0.5g，琼脂粉17g，蒸馏水1000mL, ρΗ7.0。灭菌备用。
[0019]Jensen’ s 无氮营养液:K2HP040.05g, NaCl0.05g, MgSO4.7Η200.05g, CaHPO40.25g,FeCl30.05g, ImL 微量元素溶液(Η3Β032.86g/L, MnSO4.Η202.08g/L, ZnSO4.7Η200.022g/L,CuSO4.7Η200.08g/L , NaMoO40.llg/L)，蒸馏水 1000mL0 灭菌备用。
[0020]实施例1:赣州慢生根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211的分离与鉴定
[0021]一、根瘤菌的分离
[0022]菌株分离自江西省赣州12年生黑木相思的根瘤。根瘤用自来水冲洗干净表面泥沙，于95%酒精浸泡15-30秒后，放入0.1%升汞溶液中表面消毒3-5分钟，无菌水冲洗7-8次。将经表面消毒后的根瘤放在两片无菌载玻片之间，用力挤压使根瘤破碎，用无菌接种针沾取根瘤液在YMA平板上划线，28~30°C恒温培养箱培养至菌落出现，挑取典型菌落纯化及鉴定。由此纯化得到根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211。
[0023]二、根瘤菌的鉴定
[0024]从以下几个方面鉴定根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211:
[0025]1、形态学鉴定
[0026]将上述步骤一分离并纯化的根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211培养至对数生长期，且菌落大小稳定时，进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。
[0027]对于处于对数生长期的所述根瘤菌，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。
[0028]结果表明，上述步骤一分离纯化的3株根瘤菌RITF806、RITF807及RITF211为革兰氏阴性菌，菌落圆形凸起，乳白色，半透明，表面光滑，边缘整齐；菌体杆状，1.29~
3.32X0.50~0.60 μ m，无芽孢。其透射电镜照片如图5所示。
[0029]2、生理生化特征分析
[0030]参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社，1999)测定上述根瘤菌的生理生化特征。[0031]所述根瘤菌的生理生化特征测定结果如下:
[0032]根瘤菌RITF211、RITF806、RITF807的菌落黏稠，边缘整齐；在BTB培养基上产碱；与石蕊牛奶反应产碱；菌株能利用吐温80、D-果糖、a -D-葡萄糖、D-甘露醇、β -甲基-D-葡萄糖苷、松二糖、甲基丙酮酸、柠檬酸、D-半乳糖醛酸、D，L-乳酸作为唯一碳源；能在葡糖醛酰胺、羟基-L-脯氨酸作为唯一氮源的培养基上生长；能在以下抗生素浓度(μ g/ml)的培养基上生长:氨苄青霉素5~300、氯霉素5~300、红霉素5~100、硫酸新霉素5~300、盐酸四环素5 ;能在含有1%以下染料的YMA培养基上生长:盐酸吖啶、脱氧胆酸钠、刚果红、藻红、溴百里酚蓝、龙胆紫、中性红、亚硝酸钠；过氧化氢酶实验、脲酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原反应阳性；L-苯丙氨酸脱氨酶试验、3-酮基乳糖试验、耐尔蓝还原反应、亚甲蓝还原反应阴性；不能在肉汤培养基上生长。
[0033]3、16S rRNA序列测定及系统发育分析
[0034]常规方法培养根瘤菌RITF806、RITF807和RITF211，提取菌株的总DNA作为基因扩增模板，以细菌 16S rRNA 通用引物，27F:5’ — AGAGTTTGATCCTGGCTCAG — 3M492R:5’ —TACGGTTACCTTGTTACGACTT 一 3’进行PCR反应。反应体系采用上海生物工程有限公司PCR扩增试剂盒。反应程序为:95°C变性Imin,56.7V lmin、72°C延伸1.5min，共30个循环。DNA测序由英潍捷基(上海)生物技术公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAMAN软件完成，序列比对通过美国国家生物技术信息中心NCBI数据库在线完成。
[0035]根瘤菌RITF806 (SEQ ID N0.1)、RITF807 (SEQ ID N0.2)和 RITF211 (SEQ IDN0.3)的 16S rRNA序列分别如SEQ ID N0.USEQ ID N0.2和SEQ ID N0.3所示。用 16S rRNA基因的邻接法建树(1250nt)的系 统发育树(图1),显示了 Bradyrhizobium ganzhouensesp.nov.RITF806和其他慢生根瘤菌种群之间的亲属关系。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株的3个蛋白质编码持家基因recA、glnll、atpD系统发育树见图2。根瘤菌RITF806、RITF807、RITF211菌株与其它慢生根瘤菌之间的16S rRNA和3个蛋白质编码持家基因的相似性范围见表1。
[0036]表1Bradyrhizobium ganzhouense种内菌株以及与其它慢生根瘤菌之间的16SRNA和3个蛋白质编码持家基因的相似性
[0037]
【权利要求】
1.章夤州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.ηον.) RITF806，其保藏编号为CCTCC NO:M2014044o
2.权利要求1所述的籍州慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumganzhouense sp.nov.)RITF806在制备固氮微 生物菌剂或生物有机肥中的应用。
【文档编号】C12N1/20GK103981122SQ201410117198
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】康丽华, 陆俊锟, 窦雅静, 朱亚杰, 王胜坤, 隋新华 申请人:中国林业科学研究院热带林业研究所