一种用于检测脆性x染色体综合征的cgg重复数及agg插入信息的pcr试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker；所述的引物包括：1）用于检测CGG重复数的引物F、R；2）用于检测AGG插入信息的检测引物M1、R1和验证引物M2、F1。本发明的试剂盒能精确快速分析样品CGG重复数以及AGG插入信息；能够突破现有脆性X染色体综合征检测方法采用荧光探针、MLPA、SouthernBlot、测序等难度高、耗时长、成本高的壁垒；通过凝胶电泳结果可直接分析CGG重复数的范围及AGG的插入个数从而快速诊断样品特征；采用高分辨率设备分离产物得到产物分离度，通过数学模型获得CGG重复数及AGG插入信息。
【专利说明】—种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，属于分子生物学及遗传病临床诊断领域，尤其是涉及脆性X染色体综合征及其他因三联、四联核苷酸高度重复引起的遗传疾病临床诊断领域。
【背景技术】
[0002]脆性X染色体综合征是一种发病率仅次于先天愚型的遗传性智能低下综合征，也是目前已知自闭症最常见的发病原因之一。发病率占全部儿童的0.05%,呈X连锁遗传，占X连锁智能低下的40%。95%以上的脆性X综合征患者发病的分子遗传学基础是FMR-1基因(CGG)n结构扩展的动态突变引起的，约5%以下则是由于FMR-1基因的错义突变和缺失型突变影响了脆性X智能低下基因蛋白(FMRP)的正常结构导致的。FMR-1基因是一个高度保守基因，其位于染色体Xq27.3，在基因组序列约38kb，由17个外显子和16个内含子组成，编码FMRP。在其5’端外显子上的非翻译区有一个(CGG) η三核苷酸串联重复序列，(CGG) η在重复片段长度和AGG嵌入模式上都存在多态性，并且可以遗传，在其上游大约250bp处有一个CpG岛。正常FMR-1基因(CGG) η中η介于7_55之间。当η扩展到55-200时，携带者虽表型正常，但在传代过程中易发生进一步扩展，称FMR-1基因的前突变。当η扩展达200以上时，男性表现100%为典型的脆性X综合征，女性也有30%-50%表现轻重程度不等的智能低下。这种FMR-1基因的突变称全突变。(CGG)n重复序列大量扩展，引起FMR-15’ (CGG)η侧CpG岛异常甲基化，使FMR-1基因失活，导致FMRP的缺失引起智能低下。已知的FMR-1突变有三种类型。超 过99%的脆性X综合征的患者是由三核苷酸重复顺序扩增和超甲基化所致。少于1%的患者因FMR-1基因部分缺失或点突变而致病。影响重复序列扩增的主要因素有三:重复序列的总长度，AGG中断的数目和位置以及重复序列的亲源性别。重复序列的高度扩增只见于母亲向子代的传递，而父亲的不稳定重复序列在向子代传递时，扩增的几率较低。约30%子代的重复序列比其父亲的缩短，这是所谓的重复序列收缩。
[0003]脆性X综合征发病率高，临床表现复杂，遗传规律独特，目前无有效的治疗方法，要降低其发病率，关键是查出携带者及病人，然后通过遗传咨询、产前诊断、阻止患儿出生。
[0004]检测脆性X综合征CGG重复数及AGG插入信息，可得到FMR-1第一个外显子5’端非翻译区的(CGG)n重复序列的信息。正常人群中，CGG重复数在7_55之间，常含有2_3个AGG,称为AGG中断。当CGG重复数超过60个或当AGG中断丢失导致连续的CGG超过35-40个重复后，则可能成为不稳定的三核苷酸重复序列。CGG重复数在55-200之间，通常无CpG岛超甲基化称为(CGG) η重复序列的前突变。约有20%的卵巢早衰患者被检出携带FMR-1前突变，因此，脆性X相关的卵巢早衰和前突变的病理作用有关。本发明适用于疑似卵巢功能早衰的患者的FMR-1前突变的分子检测。
[0005]现有脆性X染色体综合征检测方法采用突光探针、MLPA、SouthernBlot、测序等技术，所述现有技术操作难度高、检测耗时长、耗费成本高。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒。
[0007]本发明是用于检测脆性X染色体综合征CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker。
[0008]本发明所述的引物包括:用于检测CGG重复数的引物F、R，及用于检测AGG插入信息的检测引物Ml、Rl和验证引物M2、Fl ;所述的检测引物和验证引物均包含有搜索探针的第一引物以及位于CGG重复区侧翼相应的退火引物；所述的检测CGG重复数的上游引物F，其核苷酸序列为SEQIDN0:l-3中的任意一种，下游引物R的核苷酸序列为SEQIDN0:4_6中的任意一种；所述的检测AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列为SEQIDN0:11-13中的任意一种，下游引物Rl的核苷酸序列为SEQIDN0:17-19中的任意一种；所述的验证AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列为SEQIDN0:20-22中的任意一种，下游引物M2的核苷酸序列为SEQIDN0:14-16中的任意一种；所述的引物M1、M2在其5’端包含一段与人类基因组无关的序列S，其中序列S的核苷酸序列为SEQID NO:7-10中的任意一种，以上引物信息详见表1。
[0009]表1引物序列信息
[0010]
【权利要求】
1.一种用于检测脆性X染色体综合征的CGG重复数及AGG插入信息的PCR试剂盒，其特征在于，包括DNA聚合酶套装、PCR增强剂、引物群及校正Marker。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物包括:用于检测CGG重复数的引物F、R，及用于检测AGG插入信息的检测引物Ml、Rl和验证弓丨物M2、Fl。
3.根据权利要求1、2所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测引物和验证引物均包含有搜索探针的第一引物以及位于CGG重复区侧翼相应的退火引物。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测CGG重复数的上游引物F，其核苷酸序列为SEQ ID N0:l-3中的任意一种，下游引物R的核苷酸序列为SEQ ID NO: 4-6中的任意一种，以上引物信息详见表1。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的检测AGG插入信息的上游引物M1，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 11-13中的任意一种，下游引物Rl的核苷酸序列为SEQ IDNO: 17-19中的任意一种，以上引物信息详见表1。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的验证AGG插入信息的上游引物F1，其核苷酸序列为SEQ ID NO: 20-22中的任意一种，下游引物M2的核苷酸序列为SEQ IDNO: 14-16中的任意一种，以上引物信息详见表1。
7.根据权利要求1、2所述的试剂盒，其特征在于，所述的引物M1、M2在其5’端包含一段与人类基因组无关的序列S，其中序列S的核苷酸序列为SEQ ID N0:7-10中的任意一种，以上引物信息详见表1。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的DNA聚合酶套装为任意商业化PCR试剂盒。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的PCR扩增添加剂在另一专利中进行详述。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒中的校正Marker具有用于检测设备的校正的用途，检测设备校正曲线的R2应大于0.995。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的检测设备，可以有效分离核苷酸样品，其中结果的表现形式为琼脂糖凝胶电泳图及微流体毛细管电泳分离曲线。
12.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的检测设备为安捷伦2100生物分析仪、HPLC、ABI3730、BECKMAN MDQ系列及其他具有同等性能的分离分析设备，优选安捷伦2100生物分析仪。
13.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测方法提供一种分析致病基因FMR-1的数学模型。
14.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述检测结果是通过建立数学模型来确定CGG重复数以及AGG插入信息。
15.如权利要求1-9中任意一项所述的试剂盒应用于不限于脆性X染色体综合征临床诊断，还可以应用于其他三联、四联核苷酸高度重复引起的遗传疾病临床诊断。
【文档编号】C12Q1/68GK103981253SQ201410119503
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年3月27日 优先权日:2014年3月27日
【发明者】潘海波, 华琴, 邢楠楠, 谢阳 申请人:江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司