可稳定表达人tmprss2蛋白的单细胞自悬浮生长mdck细胞株及其构建方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长的MDCK细胞株，构建方法以及其在培养禽流感病毒中的应用。本发明属于生物【技术领域】。本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其细胞株的保藏号为：CGMCCNo.8851。同时本发明提供了这一细胞株的构建方法，以及其在禽流感病毒增殖培养中的应用方式。从而实现了禽流感病毒增殖培养中无需添加TPCK处理的胰蛋白酶，从而有效解决了外源蛋白酶对宿主细胞生长的不可逆影响，显著提高了禽流感病毒的增殖效率。
【专利说明】可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其构建方法与应用
[0001]
【技术领域】
[0002]本发明涉及一种单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其应用，特别涉及一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长的MDCK细胞株，构建方法以及其在培养禽流感病毒中的应用。本发明属于生物【技术领域】。
[0003]
【背景技术】
[0004]目前采用连续传代细胞系替代SPF鸡胚在生物反应器中进行禽流感病毒的大规模增殖制备是科研单位或兽用疫苗生产企业竞相开展的研究热点。
[0005]禽流感病毒粒子表面的HA蛋白与宿主细胞上病毒受体结合的先决条件是HA蛋白在其碱性氨基酸(Lys或Arg)位点进行有效裂解，形成HAl蛋白和HA2蛋白，这二者之间由二硫键连接。HAl蛋白负责识别宿主细胞膜上的糖链受体，HA2蛋白的N端有一段融合肽负责病毒囊膜与宿主细胞膜的融合，在H+攻击下由病毒的M2蛋白形成离子通道帮助病毒遗传物质向胞内释放，继而进入细胞核完成逆转录、复制、翻译表达等后续过程。禽流感病毒能够在SPF鸡胚中增殖的一个重要原因就是鸡胚尿囊液中含有大量的蛋白酶，能够对病毒粒子表面的HA蛋白进行裂解。而流感病毒在体外培养的动物细胞，如MDCK细胞、Vero细胞中增殖一般都需要在病毒增殖过程中添加经TPCK处理的胰蛋白酶。这种蛋白酶弱化了胰凝乳蛋白酶的活性，而增强了对碱性氨基酸(如Arg、lys)位点的裂解能力，从而能够保证禽流感病毒HA蛋白的正确裂解。
[0006]但是外源蛋白酶的添加对宿主细胞的生长状态造成的影响是不可逆的，特别是种毒连续传代后的蛋白酶积累对宿主细胞生理状态影响极为严重，进而影响禽流感病毒的增殖效率。
[0007]发明目的
本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株及其构建方法，以及这一细胞株在禽流感病毒增殖培养中的应用。
[0008]本发明具体公开了以下技术方案:
本发明公开了一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-TMPRSS2，分类命名为重组MDCK_Sus_TMPRSS2细胞，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在，北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所。其细胞株的保藏号为=CGMCC N0.8851。保藏日期为2014年3月6日。
[0009]这里TMPRSS2 是指 II 型跨膜型丝氨酸蛋白酶(type II transmembrane proteaseserines, TMPRSS2)是新近发现的一类特殊蛋白酶,该蛋白从N端往C端依次是胞内结构域(cyt0.D)、跨膜结构域(TM)、主干区(低密度脂蛋白A类受体区LDLRA、富含半胱氨酸的清道夫受体区SRCR、原结构域Pro)、消化结构域(catalytic domain)。其中跨膜区结合于细胞膜上，主干区和消化结构域则表达定位于细胞膜的外侧，具有蛋白消化酶解的功能。其蛋白的基因序列如SEQ ID N0.1所不。
[0010]同时，本发明还进一步公开所述MDCK-SUS-TMPRSS2为适应于全悬浮生长的细胞株。这一技术特征主要是区别于传统的贴壁生长的MDCK细胞。
[0011]同时，在本申请中，我们还进一步公开了单细胞自悬浮生长MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤:
1)单细胞悬浮生长MDCK细胞的悬浮转染过程
接种初始细胞密度为5X105cells/ml的MDCK-Sus细胞系于50mlTPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染，转染前将悬浮培养用培养基更换为Opt1-MEM培养基孵育10分钟；
以IOml细胞悬液为一个转染单位，将lOOulPEI试剂加入至Iml的Opt1-MEM中混匀，将10~200ug pIRES-TMPRSS2质粒载体加入至Iml的Opt1-MEM中混匀，分别在室温下孵育5分钟；
孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PE1-DNA转染复合物；
采用逐滴加入的方式将PE1-DNA转染复合物加入至10倍体积的MDCK-Sus细胞悬液中，边滴入边振荡混匀，于室温中孵育15分钟，每间隔3分钟混匀一次；
孵育结束后，将孵育后的混合物放置于摇床上培养，转速55~120rpm ；
8小时后，以1000rpm离心10分钟，将含有剩余转染复合物的培养上清去除；
添加MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养培养基继续振荡悬浮培养；
2)受转染的阳性悬浮细胞克隆的筛选
转染后18~24小时的MDCK-Sus细胞株经离心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，370C，5%C02,转速为100~200rpm，通过G418进行筛选，获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆。
[0012]具体来说，这一筛选过程为，转染后18~24小时的MDCK-Sus细胞系经离心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，37°C，5% C02，转速为100~200rpm，悬浮培养液中G418的工作浓度为400ug/ml，细胞初始密度大致为3~5X105cells/mL.按照5天换一次液的频率进行G418持续筛选，第一轮筛选时间大致为4~6周。选择能够在有G418筛选压力下持续增殖的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆继续悬浮培养传代。该传代操作以离心去除培养上清并重悬细胞沉淀来实现。第二轮筛选中将G418筛选工作浓度提高至600ug/ml继续加压筛选。最终获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆，并建系保藏。
[0013]同时，本发明进一步公开了一种细胞培养物，所述细胞培养物含有重组的MDCK-Sus-TMPRSS2 细胞。
[0014]进一步，我们还公开了所述单细胞自悬浮生长MDCK细胞株或含有重组的MDCK-Sus-TMPRSS2细胞的细胞培养物在禽流感病毒增殖培养中的用途。
[0015]同时，我们进一步公开了本发明中公开的细胞培养物不含有血清。
[0016] 更进一步地，我们还公开了所述禽流感病毒增殖培养过程中，细胞培养物中不含有TPCK处理的胰蛋白酶。
[0017]基于前述公开技术方案，本发明还进一步公开了单细胞自悬浮生长MDCK细胞株进行禽流感病毒生物反应器大规模增殖的方法，包括以下步骤:
O将重组MDCK-SUS-TMPRSS2细胞在生物反应器中进行分批与补料联合式全悬浮培养，得到MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液，
2)当MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液中的细胞密度达到4X106cells/ml时，按照MOI为0.0001~I的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖维持液；
3)病毒增殖过程中设定pH6.8~7.2，DO (溶氧)15~35%，温度28~37°C，培养3天后即可收获子代流感病毒。
[0018]进一步地，我们公开了所述病毒增殖维持液组分如下所示:
【权利要求】
1.一种可稳定表达人TMPRSS2蛋白的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，命名为MDCK-Sus-TMPRSS2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其细胞株的保藏号为:CGMCC N0.8851。
2.如权利要求1所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株，其特征在于:所述MDCK-Sus-TMPRSS2为适应于全悬浮生长的细胞株。
3.—种权利要求1或2所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: O单细胞悬浮生长MDCK细胞的悬浮转染过程 接种初始细胞密度为5X 105cells/ml的MDCK-Sus细胞系于50mlTPP培养管中，悬浮培养过夜后用于质粒转染，转染前将悬浮培养用培养基更换为Opt1-MEM培养基孵育10分钟； 以IOml细胞悬液为一个转染单位，将lOOulPEI试剂加入至Iml的Opt1-MEM中混匀，将10~200ug pIRES-TMPRSS2质粒载体加入至Iml的Opt1-MEM中混匀，分别在室温下孵育5分钟； 孵育完成后将上述两个混合液采用逐滴加入的方式混匀，在室温下孵育15分钟，形成PE1-DNA转染复合物； 采用逐滴加入的方式将PE1-DNA转染复合物加入至10倍体积的MDCK-Sus细胞悬液中，边滴入边振荡混匀，于室温中孵育15分钟，每间隔3分钟混匀一次； 孵育结束后，将孵育后的混合物放置于摇床上培养，转速55~120rpm ； 8小时后，以1000rpm离心10分钟，将含有剩余转染复合物的培养上清去除； 添加MDCK-Sus细胞株的正常悬浮培养培养基继续振荡悬浮培养； 2)受转染的阳性悬浮细胞克隆的筛选 转染后18~24小时的MDCK-Sus细胞株经离心回收按照1:2~1:12的比例重新分散至15ml新鲜悬浮培养液中培养，370C，5%C02,转速为100~200rpm，通过G418进行筛选，获得能够在G418筛选抗性中稳定持续悬浮生长的重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞克隆。
4.一种细胞培养物，其特征是，所述细胞培养物含有权利要求1-3中任意一项所述的MDCK-Sus-TMPRSS2 细胞。
5.权利要求1-3中任一项所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株或权利要求4中所述的细胞培养物在禽流感病毒增殖培养中的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征是，所述细胞培养物中不含有血清。
7.如权利要求5或6所述的用途，其特征是，禽流感病毒增殖培养过程中，细胞培养物中不含有TPCK处理的胰蛋白酶。
8.一种利用权利要求广3中任意一项所述的单细胞自悬浮生长MDCK细胞株进行禽流感病毒生物反应器大规模增殖的方法，其特征是包括以下步骤: O将重组MDCK-Sus-TMPRSS2细胞在生物反应器中进行分批与补料联合式全悬浮培养，得到MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液， 2)当MDCK-Sus-TMPRSS2细胞培养液中的细胞密度达到4X106cells/ml时，按照MOI为0.0001~I的比例接入禽流感病毒以及病毒增殖维持液； 3)病毒增殖过程中设定pH6.8~7.2，DO (溶氧)15~35%，温度28~37°C，培养3天后即可收获子代流感病毒。
9.如权利要求8所述的禽流感病毒生物反应器大规模增殖的方法，其特征是:所述病毒增殖维持液组分如下所示。
【文档编号】C12N5/10GK103937748SQ201410130367
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】冯磊, 吴培培, 褚轩, 王伟峰, 华涛, 陈丽, 侯继波 申请人:江苏省农业科学院