单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法及其专用单克隆抗体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法及其专用单克隆抗体，是以重组表达的p60为抗原，筛选特异性抗单核细胞增生性李氏杆菌的单克隆抗体，用生物素标记p60单抗，再利用辣根过氧化物酶标记的亲和素为第二抗体，建立基于生物素化单抗的单核细胞增生性李氏杆菌的A-BELISA检测和定量方法。本发明的有益效果为，本发明所涉及的A-BELISA方法，不仅克服了传统通过细菌培养、鉴定李氏杆菌种费事费力敏感性低的缺点，而且应用生物素（B）-亲和素（A）酶放大系统，使A-BELISA比已有的ELISA方法更敏感，检测限更低，此外，还可以通过建立的标准曲线，对待检抗原进行定量分析，该方法敏感性高，更加易于规范化、标准化和产业化。
【专利说明】[0001] 单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法及其专用单克隆抗体
【技术领域】
[0002] 本发明涉及单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法及其专用单克隆抗体。
【背景技术】
[0003] 单核细胞增生性李斯特菌（Listeria monocytogenes, LM)简称单增李斯特菌， 是一种能引起人畜共患病和食源性疾病的致病菌，该菌属于细胞内寄生的革兰氏阳性杆 菌，人畜感染后，主要表现为脑膜炎、败血症和血液中单核细胞增多等症状，死亡率达20? 30%，该菌在自然界广泛存在，食品中存在的单核细胞增生性李斯特菌对人类安全构成很大 威胁，是21世纪对人类健康具有重大影响的12种病原微生物之一。
[0004] 李氏杆菌属包括单增李氏杆菌（Listeria monocytogenes)、伊氏李氏杆菌 (Z. 、无害李氏杆菌（Z. i/wocwa)、威斯梅尔氏李氏杆菌（Z. 、西里杰 氏李氏杆菌仏。除L. Μ对人畜致病性高外，其它的都致病力很小或无致病力， 而且在自然界中普遍存在。因此，如何区分食品污染的是致病性李氏杆菌还是其它常在李 氏杆菌，是食品工业或动物李氏杆菌病免疫学诊断的首要课题。目前，传统的L. Μ检测方法 因细菌分离、增菌以及鉴定所需时间较长，花费人力物力较大，不适合快速检测的需要，其 他检测方法，如PCR法、基因探针等方法，需要昂贵的实验仪器，而且特异性差，因此很不 适合在现场对大量样品进行检测，如何提高L. Μ的检出率的同时缩短检测时间已经成为各 国科技工作者急需解决的问题。
[0005] 国内外一些学者对单增李斯特菌单克隆抗体的制备以及ELISA检测方法进行了 很多研究，Boerlin等学者用重组的LL0和ini A作为EL ISA诊断抗原检测牛的L Μ抗 体，结果敏感性特异性分别达82%和92%，说明用基因工程生产的抗原建立的ELISA方法 完全可以用于LM的诊断和检测。Vazquez- Boland J A等学者用纯化的重组溶血素蛋白 包被聚苯乙烯板，利用间接ELISA的方法已经成功的检测出绵羊感染的单核增生性李斯特 杆菌，并且抗原的包被条件和其他反应条件已经被优化。崔焕忠等人以致病性李斯特菌 ActA蛋白为对象，原核表达了 ActA蛋白，制备了抗ActA特异性单克隆抗体，并从中选取2 株单克隆抗体分别用于免疫胶体金标记和胶体金试纸检测线的包被，从而研制成了检测LM 的胶体金试纸。秦玉敏用纯化的重组LL0蛋白免疫小鼠，获得6株稳定分泌抗LL0单克隆 抗体的杂交瘤细胞株，以制备的腹水单抗为诊断抗体，用此诊断抗体分别与BHI培养基和 TSB-YE培养基培养的不同时段的LM0上清发生反应，建立了阻断ELISA检测LM0的方法。 但这些研究大都以ActA、LL0等为研究对象，有关p60的单克隆抗体及检测试剂盒的研究目 前还很少。Yu等筛选出了抗p60的单克隆抗体，建立了检测单增李氏杆菌的ELISA方法。 该方法虽然快速简单，但敏感性和特异性与间接ELISA相当，也不能进行定量分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可快速检测食品及动 物体内致病性单核细胞增多性李氏杆菌的检测方法。
[0007] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交 瘤细胞株6C2,其保藏编号为CGMCC No. 8768。
[0008] 小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交瘤细胞株6C2,已于2014年3月3日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址，北京市朝阳区北辰西路1 号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No. 8768。
[0009] 本发明的第二个目的，是提供了单核细胞增生性李氏杆菌p60单克隆抗体，是由 保藏编号为CGMCC No. 8768的小鼠骨髓瘤细胞与脾细胞的杂交瘤细胞株6C2产生的。
[0010] 本发明的第三个目的是提供了单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法，是用纯化的 重组单核细胞增生性李氏杆菌P60蛋白作为免疫原制备得到上述的杂交瘤细胞株6C2,筛 选出能特异性识别单核细胞增生性李氏杆菌P60的上述的单核细胞增生性李氏杆菌p60单 克隆抗体，并进行生物素化处理，以A-B ELISA方法建立定性检测和定量分析单增李氏杆菌 P60的检测方法。
[0011] 进一步的，上述的单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法，包括以下步骤： 1) ρ60蛋白的表达及纯化： 提取单核细胞增生性李氏杆菌4b的基因组DNA，PCR扩增p60基因，定向克隆入 pET-30a表达载体，用IPTG进行诱导表达； 2) 杂交瘤细胞株的建立： 用纯化的P60蛋白作为免疫原反复免疫Balb/c小鼠，将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫 小鼠脾细胞在500g/L PEG介导下进行融合，获得杂交瘤细胞株； 3) 抗p60单克隆抗体的筛选与鉴定： 将P60抗原包被酶标板，用间接ELISA筛选阳性细胞克隆，得到4株抗单核细胞增生性 李氏杆菌P60蛋白的杂交瘤细胞株（6C2,2E4,3H5,5F8)。分别取细胞培养上清液，利用单克 隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型及亚型，其中2E4、5F8和6C2 为IgGl亚型，3H5为IgG2a亚型。将杂交瘤接种小鼠腹腔收集腹水，测定2E4的腹水效价 为 1 :104,3H5 为 1:104，5F8 为 1 :103,6C2 为 1:106; 4) 单克隆抗体的生物素化： 将单抗用饱和硫酸铵沉淀，然后用蛋白G柱进行纯化，测定蛋白含量后用生物素进行 标记； 5) 单增李氏杆菌特异P60单抗的筛选： 用生物素化的P60单抗分别包被酶标板，将李氏杆菌属所有菌株过夜培养的上清加入 酶标反应孔，根据反应测定的0D值大小，筛选获得与单核细胞增生性李氏杆菌特异性反应 强的单抗株6C2 ; 6) A-B ELISA检测方法的建立： 用生物素化的单核细胞增生性李氏杆菌特异性6C2单抗包被酶标板，将李氏杆菌属所 有菌株过夜培养菌液的上清作为检测抗原加入酶标板中，再加入生物素化的单抗和辣根过 氧化物酶标记的链霉亲和素，测定〇D630nm的值； 7) 待检样品的定量分析： 将表达纯化的重组p60作为标准品溶液（2000pg/ml )，倍比稀释后加入反应孔中，再加 入生物素化6C2单抗和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，测定每孔的0D630nm值，根据测 定结果绘制不同浓度重组P60与其吸光值（0D)之间的标准曲线。用待检样品代替标准品 进行如上操作，根据所测0D值即可从标准曲线获得待检样品的浓度。
[0012] 本发明的有益效果为： 本发明在筛选单增特异性P60单克隆抗体的基础上，应用生物素（B)-亲和素（A)信号 放大系统，大大提高了检测的敏感性和特异性。再结合建立的标准曲线，即可实现对待检样 品中靶抗原的定量分析。本发明所涉及的A-B ELISA方法，不仅克服了传统通过细菌培养、 鉴定李氏杆菌种费事费力敏感性低的缺点，而且应用生物素（B)-亲和素（A)酶放大系统， 使A-B ELISA比已有的ELISA方法更敏感，检测限更低，此外，还可以通过建立的标准曲线， 对待检抗原进行定量分析，该方法敏感性高，更加易于规范化、标准化和产业化。
【专利附图】
【附图说明】
[0013] 图1为SDS-PAGE分析重组P60蛋白的纯化效果。
[0014] 其中，泳道Μ :蛋白质标准分子量，泳道1 :诱导表达产物，泳道2 :纯化后的重组蛋 白。
[0015] 图2为抗Ρ60单克隆抗体的亚型鉴定结果。
[0016] 图3为单克隆抗体腹水SDS-PAGE电泳（图3-Α)和纯化分析（图3-Β)。
[0017] 图3-Α中，泳道Μ :蛋白质标准分子量；泳道1为2Ε4腹水；泳道2为纯化后的2Ε4 蛋白；泳道3为3Η5腹水；泳道4为纯化后3Η5蛋白；泳道5为5F8腹水；泳道6为纯化后 5F8蛋白；泳道7为6C3腹水；泳道8为纯化后6C3蛋白。
[0018] 图3-Β中，泳道Μ :蛋白质标准分子量（从上到下蛋白分子量分别为170ku，130ku， 72ku，55ku，43ku，17ku，10ku);泳道1为纯化后的2E4蛋白；泳道2为纯化后5F8蛋白；泳 道3为纯化后6C2蛋白。
[0019] 图4为四株单抗与李氏杆菌属不同菌株培养上清的夹心ELISA反应结果。
[0020] 其中，各标注分别为：单核细胞增多性李氏杆菌ΓΖ. L. M， 4B，4D是其2个不同的血清型)、绵羊李氏杆菌(Z. LIV和LBA)、无害李氏杆菌 CL. i/wocwa, LIN)、威斯梅尔氏李氏杆菌(Z. LW)、西里杰氏李氏杆菌(人 sedigeri，LS )，空白样品（B1 ank, K )。
[0021] 图5为A-B ELISA定量分析的标准曲线。
[0022] 其中，横坐标为标准品的浓度，纵坐标为所测的0D630nm。
【具体实施方式】
[0023] 本发明提供的检测方法是以筛选的单增李氏杆菌p60特异单抗为基础，并进行生 物素化处理，大大提高了检测的特异性和敏感性。国外也有用筛选的P60单抗进行夹心 ELISA检测的报道，但与本发明有明显区别。本发明所涉及的检测技术，一是所用单抗株与 国外相关技术不同，二是利用了生物素-链霉素酶放大系统。因此，理论上应明显优于国外 同类检测技术。
[0024] 实施例1 : 1、免疫抗原的制备： 将携带PET-P60质粒的BL21重组菌株37°C培养过夜，将菌液按1. 0%接种入含卡那霉 素（5(^g/mL)的2XYT培养基中，37°C剧烈振摇3?4 h，加 IPTG (终浓度为1 mmoL/L)诱 导4?5 h。将诱导表达的菌液离心收集菌体，反复冻融及超声波处理后收集上清，用镍琼 脂糖凝胶FF纯化回收目的蛋白，用SDS-PAGE分析重组P60蛋白的纯化效果（如图1所示）， 用 Thermo Scientific Nano Drop 2000 测定蛋白浓度。
[0025] 2、Balb/c小鼠的免疫与细胞融合： 首次免疫用纯化P60蛋白100 μ g加等量福氏完全佐剂，混匀成乳剂，皮下注射6?8 周龄雌性BALB/c小鼠，此后改用福氏不完全佐剂乳化抗原，隔20d免疫注射1次，共免疫3 次。于融合前3d，经小鼠脚掌肌肉加强免疫后，断尾采血，用间接ELISA检测小鼠血清抗体 效价。选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫小鼠脾细 胞（1:10)在500 g/L PEG介导下进行融合。加入含有次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶核 苷（HAT)的RPMI 1640选择性培养液，在37°C、5%C02条件下培养2周后换次黄嘌呤2胸腺 嘧啶核苷(HT)培养液培养。
[0026] 3、杂交瘤细胞的克隆与亚型鉴定： 将检测出的阳性杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆化培养。当细胞生长至铺满孔底 1/4?1/3时，再用同样方法进行检测，选择阳性值高的单克隆细胞株进行再克隆，直至阳 性率达到100 %。用P60抗原包被酶标板，每孔100 μ L，4 °C包被过夜。按100 μ 1/孔加 入杂交瘤培养上清液，37°C反应1 h，洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 IgG抗 体，每孔100yL，37 °C反应lh，洗涤3次，再加入底物（0PD)显色，每孔100yL，并用2mol/ L H2S04终止，每孔50 μ L，在酶标仪上测定0D630值。阴性对照孔为1 :200的正常Balb/c 小鼠血清，阳性对照孔为1 :200的免疫小鼠血清。
[0027] 经细胞融合与克隆筛选，共获得4株p60单克隆抗体杂交瘤细胞株，分别为2E4、 5F8、3H5和6C2。单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定表明（如图2所示），2E4、5F8和6C2 为IgGl亚型，3H5为IgG2a亚型。
[0028] 4、单克隆抗体腹水的制备与效价测定： Balb/c小鼠腹腔注射0.5 mL液体石蜡（高压灭菌)，7?10 d后腹腔注入IX 106? 5X106个杂交瘤细胞，注射后7?10 d可见小鼠腹部明显膨大，进行无菌操作采集腹水。 用吸管收取腹水，l〇〇〇r/min离心10 min，弃去最上层的脂肪层，收集中间层液体，即为单 克隆抗体腹水。用重组P60抗原包被96孔酶标板，4°C过夜，将粗纯的腹水10倍系列稀释 (1 :10?1 :109)，采用间接ELISA测定2E4的腹水效价为1 :104,3H5为1 :104,5F8为1 :103， 6C2 为 1 :106。
[0029] 采用饱和硫酸铵沉淀法结合HiTrap Protein G HP Columns纯化腹水，进行 SDS-PAGE 分析，Thermo Scientific Nano Drop 2000 测定纯化后腹水的浓度。
[0030] 5、四株单克隆抗体的抗原表位分析： 用P60抗原包被酶标板，将腹水按不同比例稀释，用间接ELISA以进行腹水亲和力的测 定。四株单抗识别抗原表位的分析结果如表1所示。根据表1数据计算表明，2E4与3H5识 别相同的抗原表位，2E4与5F8识别相同的抗原表位；2E4与6C2识别相同的抗原表位；3H5 与5F8识别相同的抗原表位；3H5与6C2识别相同的抗原表位；5F8与6C2识别相同的抗原 表位。
[0031] 表 1
【权利要求】
1. 单核细胞增生性李氏杆菌P60蛋白杂交瘤细胞株6C2,其保藏编号为CGMCC No.8768。
2. 单核细胞增生性李氏杆菌p60单克隆抗体，其特征在于，是由保藏编号为CGMCC No. 8768的单核细胞增生性李氏杆菌p60蛋白杂交瘤细胞株6C2产生的。
3. 单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法，其特征在于，是用纯化的重组单核细胞增生 性李氏杆菌P60蛋白作为免疫原制备得到权利要求1所述的杂交瘤细胞株6C2,筛选出能 特异性识别单核细胞增生性李氏杆菌P60的如权利要求2所述的单核细胞增生性李氏杆菌 P60单克隆抗体，并进行生物素化处理，以A-B ELISA方法建立定性检测和定量分析单增李 氏杆菌p60的检测方法。
4. 根据权利要求3所述的单核细胞增生性李氏杆菌的检测方法，其特征在于，包括以 下步骤： 1) ρ60蛋白的表达及纯化： 提取单核细胞增生性李氏杆菌4b的基因组DNA，PCR扩增p60基因，定向克隆入 pET-30a表达载体，用IPTG进行诱导表达； 2) 杂交瘤细胞株的建立： 用纯化的P60蛋白作为免疫原反复免疫Balb/c小鼠，将小鼠骨髓瘤细胞SP2/0与免疫 小鼠脾细胞在500g/L PEG介导下进行融合，获得杂交瘤细胞株； 3) 抗p60单克隆抗体的筛选与鉴定： 将P60抗原包被酶标板，用间接ELISA筛选阳性细胞克隆，得到4株抗单核细胞增生性 李氏杆菌P60蛋白的杂交瘤细胞株，分别为6C2, 2E4, 3H5, 5F8,取细胞培养上清液，利用单 克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型及亚型，其中2E4、5F8和6C2 为IgGl亚型，3H5为IgG2a亚型，将杂交瘤接种小鼠腹腔收集腹水，测定2E4的腹水效价为 1 :104,3H5 为 1:104，5F8 为 1 :103,6C2 为 1:106; 4) 单克隆抗体的生物素化： 将单抗用饱和硫酸铵沉淀，然后用蛋白G柱进行纯化，测定蛋白含量后用生物素进行 标记； 5) 单增李氏杆菌特异P60单抗的筛选： 用生物素化的P60单抗分别包被酶标板，将李氏杆菌属所有菌株过夜培养的上清加入 酶标反应孔，根据反应测定的0D值大小，筛选获得与单核细胞增生性李氏杆菌特异性反应 强的单抗株6C2 ; 6. A-B ELISA检测方法的建立： 用生物素化的单核细胞增生性李氏杆菌特异性6C2单抗包被酶标板，将李氏杆菌属所 有菌株过夜培养菌液的上清作为检测抗原加入酶标板中，再加入生物素化的单抗和辣根过 氧化物酶标记的链霉亲和素，测定〇D630nm的值； 7) 待检样品的定量分析： 将表达纯化的重组P60作为2000pg/ml的标准品溶液，倍比稀释后加入反应孔中，再加 入生物素化6C2单抗和辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，测定每孔的0D630nm值，根据测 定结果绘制不同浓度重组P60与其吸光值之间的标准曲线，用待检样品代替标准品进行如 上操作，根据所测0D值即可从标准曲线获得待检样品的浓度。
【文档编号】C12N5/20GK104099299SQ201410130271
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年4月2日 优先权日:2014年4月2日
【发明者】骆学农, 才学鹏, 王佩雅, 朱学亮, 王芳, 张少华 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所